【求助】]今天刚做的二维结果，问题出在哪里？

最新回复

• chengjie79 (2014-6-21 10:33:22)

  
  我自己觉得可能的原因，一个是一维的总的聚焦没用达到40000vhs但是要达到这个数一维就需要跑25h这样对胶是不是有影响？还有上样量太大了吗对于银染来说？

• chengjie79 (2014-6-21 10:33:42)

  我的银染背景很深，看到别人的结果几乎没什么背景这是为什么呢？哪些因素影响背景？

• nvdabing (2014-6-21 10:34:04)

  
  那是背景的问题，应该是在银染的时候使用的药剂特别是水的问题。试试用去离子水吧！不过我没有从图上看出聚焦不彻底的反应。蛋白电少应该是其他的原因造成的！不如蛋白提取方法的原因或者是材料本身的原因.有些材料的蛋白种类本来就不多！

• chengjie79 (2014-6-21 10:34:42)

  我做银染时用的就是去离子水而且做的是全细胞裂解的样品所以点肯定不能这么少的！我看这个胶左边的点还行但是右边的点就是特别少，这是为什么？

• chengjie79 (2014-6-21 10:35:30)

  还有我每次在这个版发文都要我修改标题上次是说没有表明类型是求助这次我特意表明了是求助还是要我修改标题，版主能给我解释一下吗？谢谢

• bamboo16 (2014-6-21 10:35:48)

  
  背景深的原因可能有：1。水，必须用去离子水；
  2。各种溶液尽量新鲜配制；
  3。操作时尽量不要用手或其他工具接触凝胶；
  我建议的一向聚焦的参数是：
  30v ，10小时； 500v ，0.5小时； 1000v ， 0.5小时；3000v，1小时；
  5000v，1小时；8000v，至结束（大概80000vhs）。
  另外电压上不去，可能和样品制备有关，盐离子浓度也有影响，建议查一些文献，改进制备方法。

• avi317 (2014-6-21 10:37:31)

  你的marker很好啊
  是怎么加的？用梳子吗？我的梳子太大装不下啊

• chengjie79 (2014-6-21 10:38:03)

  QUOTE:

  原帖由 bamboo16 于 2014-6-21 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  背景深的原因可能有：1。水，必须用去离子水；
  2。各种溶液尽量新鲜配制；
  3。操作时尽量不要用手或其他工具接触凝胶；
  我建议的一向聚焦的参数是：
  30v ，10小时； 500v ，0.5小时； 1000v ， 0.5小时；3000v，1小时；
  5000v，1小时；8000v，至结束（大 ...

  谢谢你的解答，你的聚焦参数80000是指多大的胶？我的是13cm的要不了这么多吧！还有一个问题聚焦这么长时间，对胶本身没有影响吗比如胶因为太久了破了或缺损了什么的？

• chengjie79 (2014-6-21 10:38:36)

  marker挺好用的，是直接用滤纸点上marker加的不过我的滤纸是随机器带过来的！

• mamamiya (2014-6-21 10:38:58)

  这个是18cm的标准，13cm不用这么长。
  我们用的是干胶条，一般20小时左右不会有损坏。

• ROSE李 (2014-6-21 10:39:19)

  你的电泳设置可以在2000v,4000v再设置step,即30v，12h；500,1h；1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h,8000v，4h.
  这样设置是因为前面几个step是为了进一步去除胶内离子,同时促聚.一般来说再1000和2000的时候要调控,如果8000时每根gel的电流不能超过55ua的话.4000升8000的时候电流就不能超过27ua.以此往前推,所以在1000和2000的时候看电流降的不够低就要再增加0.5h,让离子尽量跑出去,电流降下来.关键是要保证能上到8000,同时保证8000v4小时的高压聚焦.这样总vh差不多答道40000vh.
  还有就是你的上样量时有点少.我可以答道1.2mg的

• chengjie79 (2014-6-21 10:39:50)

  你的电泳设置可以在2000v,4000v再设置step,即30v，12h；500,1h；1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h,8000v，4h.
  这样设置是因为前面几个step是为了进一步去除胶内离子,同时促聚.一般来说再1000和2000的时候要调控,如果8000时每根gel的电流不能超过55ua的话.4000升8000的时候电流就不能超过27ua.以此往前推,所以在1000和2000的时候看电流降的不够低就要再增加0.5h,让离子尽量跑出去,电流降下来.关键是要保证能上到8000,同时保证8000v4小时的高压聚焦.这样总vh差不多答道40000vh.
  还有就是你的上样量时有点少.我可以答道1.2mg的
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  呵呵，很感谢楼上站友的详细解答。我下次的时候试试你的一维参数，不过你能告诉我为什么加了1000,0.5h；2000v,0.5h,4000,0.5h就能壤离子跑出去吗？谢谢

• chengjie79 (2014-6-21 10:40:18)

  
  这么多天之后，经过了很多的改进结果是有点进步但是还是有不少问题还是要请教各位高手阿！过程大致如下：一维总的伏小时56000,觉得时间应该是够了然后裂解液呢是urea，ultraurea，chaps，dtt，现在明显点是多起来了但是从结果上来看还是有两个问题没有解决。一个是阳性端的横向脱尾还是很严重，另外一个是点还是不太清楚好像聚焦还是不够？我这次的裂解液的配方是这样的：urea , ultraurea ，chaps，然后是1000ul的泡胀液中加 5ul的IPG BUFFER，dtt现加。裂解后基本没有沉淀，我觉得裂解应该是蛮充分的了，18000离心后上样！步骤基本上我已经很熟练了我觉得问题应该还是出在样品处理和一维上吧！您看我现在的问题出在哪呢？

  
  30305476.snap.jpg

• yonger (2014-6-21 10:40:36)

  
  从背景看有点脏，但胶条以外的胶并不脏，我感觉还是样品制备或一向出问题了，应该不是银染的问题

• chengjie79 (2014-6-21 10:41:08)

  
  胶我觉得还好了，我自己感觉是样品制备的问题不知道其他同学有什么建议吗我做的是平滑肌细胞！