【求助】PVDF膜和NC膜

最新回复

• qhyu (2014-7-05 17:01:41)

  技术支持的回复应该是错误的，据我所知膜在甲醇里浸泡的时间可以长到数十分钟甚至一个小时，因此转膜转不上与浸泡时间没有必然联系。
  既然用NC 膜和PVDF膜同时转，同样的条件。结果NC膜转的很好，PVDF膜就过了。所以可以肯定地说PVDF膜本身存在问题。

• yychen (2014-7-05 17:01:59)

  
  PVDF膜只能在甲醇里泡不超过10秒，我们用一般泡5秒，平衡一般是15min，你把膜都泡散架了怎么转啊。

• BUK (2014-7-05 17:02:26)

  我们实验室一个叫小胖的人也遇到了同样的情况,不知道为什么，我估计是不是转移缓冲液的浸泡时间太短了，甲醇处理后,转移缓冲液应该处理长点的时间比较好

• daod (2014-7-05 17:02:43)

  
  可能是甲醇处理时间有点长了，10秒就足够了，可以再试一下，我这样处理，湿转过夜都没有问题。另外，转移缓冲液的浸泡时间应该也不会影响这么大。

• shkudo (2014-7-05 17:03:04)

  谢谢大家热心的回答，我又问了技术支持。他还把MILLIPORE的handbook也带来了。我又好好学习了一下。
  书上说PVDF膜在甲醇中泡15秒以上，没有说上限。在缓冲液的平衡时间是15~30分钟。我看了一下，觉得就是一点和书上的不同，就是在甲醇中浸泡后在蒸馏水中要泡2分钟。我是把膜从甲醇中拿出来后直接放到缓冲液中。不知道这点是不是影响很大？

• taoshengyijiu (2014-7-05 17:03:36)

  
  我最近一星期一直在做WB，开始时，我转的也不好，时间是一样的，有时转的刚好，有时转过，有时转了一点，我最先开始怀疑的的就是PVDF膜，所以我严格控制我的PVDF膜在甲醇里泡过2MIN、用双蒸水冲3遍，转膜液15MIN，转的效果很好，但后来PVDF膜在甲醇里泡3MIN、4MIN，还泡过7MIN，转膜时间都一样，但转的效果也很好，后来就怀疑胶浸泡的时间问题，后来也排除了，那就只有转膜液了，我每次用完大还倒回去，后来我每次用新的，结果转的时间一定（时间长短自己摸好了），转的效果一般都很好，所以我打算配点转膜贮存液，这样就能保持条件一样了。你也试试看，这只是我的体会，不知正确否。

• shkudo (2014-7-05 17:03:58)

  
  谢谢楼上的朋友。
  转印的条件我摸了快一个月了。这个元旦都没有过好。先是半干转，后来是湿转。膜上的MARKER一直转不好。MARKER的上样量从5微升（推荐量）到8微升到10微升，都只看到一到两条MARKER条带在膜上。
  这个元旦我按照millipore的handbook处理膜，每次也用的新的转印缓冲液，结果还是一样。很容易转过了。
  今天我用NC膜和PSQ膜再转（条件和PVDF膜一样），NC膜上的MARKER条带就好的很，PSQ膜有一些条带，比PVDF膜强。我想我是不是要用NC膜了。唉！

• kswl870 (2014-7-05 17:04:26)

  
  同情楼上的朋友，PVDF膜本身是疏水的，甲醇润湿的目的在于把膜有疏水转换到亲水，此时膜有不透明变为半透明，根据你的处理，我想这一步问题不大。另外，需要注意你的蛋白大小，你后来提到0.2孔径的，我想这与你的蛋白小有关，你也可以看一下胶里的蛋白是否转移出去。我看过millipore的handbook英文版和中文版，里面有具体的方法。

• kswl870 (2014-7-05 17:04:46)

  
  另外，个人觉得pvdf为惰性材料，我想不太会出现散架现象吧。另外，注意一下转移缓冲液中SDS的浓度。

• shkudo (2014-7-05 17:05:06)

  我现在的问题不是转不上，是老转过。虽然条带可以做出来，但是很淡。marker的条带很不清晰。我的转移缓冲液配方是48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇。我也试过没有SDS的缓冲液，转的效率很低，基本上转不过去。所以现在一直用加SDS的。
  我今天试了NC膜和PSQ的膜，都比PVDF膜好。不知道原因，身心疲惫啊！

• yueban-1147 (2014-7-05 17:05:28)

  我用的pvdf膜，感觉还可以阿，就是丽春红染不上，不知道什么原因阿。请教各位。我用靠马斯亮蓝染色发现转的还行。

• memory (2014-7-05 17:05:45)

  
  PVDF 膜在丽春红染色结束后,倒走染液,先加一点甲醇,均匀的遍及整个膜,然后用水冲洗,这样就可以清楚的看到条带了,而且条带也不容易被水洗去.这是我做了很多染色后发现的.我原来也有伦伦同样的问题.你可以试试.

• jujuba (2014-7-05 17:06:16)

  
  直接在转移缓冲液中浸泡一下就可以了，我做过无数次没有发现有啥问题

• shkudo (2014-7-05 17:06:51)

  
  又做了n次实验，被实验室的同学都评为“探索之星”了。也问了一些别的实验室的老师同学，现在结合起来再来谈我的个人体会：
  关于膜的选择，应该是PSQ膜比PVDF膜好用。同样的处理，PSQ膜透膜的几率要小很多（这个在millipore的handbook中也有说，还有图为证。）我试过PSQ膜10ma（4v）湿转过夜 ，130kda的可以做出来。而用PVDF膜就很容易转透。
  NC膜透膜的几率也小，不过我做的感觉是条带没有PSQ膜的清晰。MARKER倒是转的很好看，目的条带就差一些。
  请大家再来谈谈自己选膜的体会吧。