【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么？

最新回复

• 8princess8 (2016-4-09 10:30:35)

  
  消毒不严格吧？

• 33号 (2016-4-09 10:32:15)

  A260/A280的Ratio低说明提取的RNA纯度低
  加氯仿后离心的转数跟时间够不够？
  还有很重要的一点就是：离心之后吸上清，中间有一层白白的东西，那一层一点点都不能吸，宁愿上清少吸一点也不能把那层吸进去了，一吸，纯度就降了。
  我以前也是把上清吸得很干净，把中间那一层都吸了。纯度一直都上不去，后来同学跟我说过不能吸中间那一层之后，纯度就都很高了～

• 8princess8 (2016-4-09 10:32:30)

  我的一个老师说RNA使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定会比较高，（我没试过，都是用DEPC水溶解和测量的） 如果用DEPC水来溶解测量，相对稍低一些，但也不至于象楼主那样1.4左右，楼主是使用得试剂盒吗？我用试剂盒提取的一般在1.7～1.9，常在1.8多，有时候还会高于2.0，但是对实验结果影响不大，如果不用试剂盒，1.3多也是有可能的，我也曾经作出过结果。一般来说，低离子强度或低pH值会使OD280值升高，估计是楼主的DEPC水出了问题吧。
  另外一个原因就是样品裂解时加入的试剂量偏少，或者组织块偏大，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。

• 9900 (2016-4-09 10:33:08)

  
  谢谢大家的宝贵意见！太感谢了！
  我用的不是试剂盒提取，样品裂解时50mg左右的组织加入1mlISOGEN，不知道这个量是不是可以？
  homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃，不知道这样的设置转速和时间是不是够？
  吸取上清时为避免吸取中间层我用166ulpipette吸取三次，第三次时只是看上清残余情况取适量，这样应该可以排除中间层影响的可能性了吧？
  如果真的是EDPC水出了问题的话我该采取什么措施呢？
  请高手指教！

• 831226 (2016-4-09 10:33:24)

  50～100mg左右的组织加入1mlISOGEN都没有大问题。
  homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃还可以，只是楼主加入chloroform有没有剧烈震荡啊？这一步的剧烈振荡十分关键的，不然就可能有蛋白。
  吸取上清注意了应该问题不大。
  DEPC水换一个公司的试试。测OD值用的时候换新配制的试试。

• 101010 (2016-4-09 10:33:49)

  我在做RNA提取时A260/A280的Ratio总是徘徊在1.4左右，反复找原因后发现在其他操作及条件均相同的情况下，DEPC水不同得出的Ratio也不同。
  问题是：用买的两家公司的DEPC水和自己配制的DEPC水都得不到理想结果，只有用以前一位前辈用过的分装后未注明来源且所剩无几的DEPC水可以得到理想结果！！！
  郁闷死我了！哪位前辈可以给我指点迷津呀？请帮帮我！！！
  ......
  
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  这个应该不是拫重要,比值只是一个参考,我们实验室(科技部的一个重点实验室)在做反转的时候,一般不怎么考虑A260/A280的比值.若果,你后面的实验要求很高,如建文库什么之类的话,那就要考虑这个值了!希望能对你有用.

• 101010 (2016-4-09 10:34:46)

  260/280值低说明蛋白含量高，有可能是离心后取上清的时候不小心吸到的中间的蛋白层.可以在提取后做PCI抽提,乙醇精制来除去蛋白.

• 101010 (2016-4-09 10:35:52)

  我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好.

• 小螺号 (2016-4-09 10:36:20)

  QUOTE:

  原帖由 101010 于 2016-4-9 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好. ...

  谢谢您的意见！
  不好意思，我是新手，对相关的词汇都还没弄很明白，请问一下：TE是指？

• 小螺号 (2016-4-09 10:36:41)

  QUOTE:

  原帖由 831226 于 2016-4-9 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  50～100mg左右的组织加入1mlISOGEN都没有大问题。
  homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃还可以，只是楼主加入chloroform有没有剧烈震荡啊？这一步的剧烈振荡十分关键的，不然就可能有蛋白。
  吸取上清注意了应该 ...

  谢谢您的意见！
  第一次做实验时，加入chloroform后确实没有震荡，结果chloroform都很安静地躺在下层，一点儿作用都没起，没办法又重新震荡离心了一遍，幸亏用的是练习用的sample。呵呵，现在回想起来还觉得挺好笑的。也感觉做实验确实能体会到失败是成功之母这样的道理。只是希望借助大家的帮助我能够顺利从这一步的失败中走出来。

• 65urh (2016-4-09 10:37:05)

  不好意思，我是新手，对相关的词汇都还没弄很明白，请问一下：TE是指？
  
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  TE就是TE buffer，TE缓冲液。祝实验成功！

• 45778 (2016-4-09 10:37:58)

  OD260/280 在提取组织RNA，进行RT-PCR等类似实验操作中，仅仅是个参考，只要确认自己的实验操作无误，比值1.3多也能RT成功，PCR做出很漂亮的条带来
  OD值受很多因素影响，它的比值不如参考书上的那么标准，并不能完全代表你的实验结果不好

• 8princess8 (2016-4-09 10:38:40)

  OD260/280 在提取组织RNA，进行RT-PCR等类似实验操作中，仅仅是个参考，只要确认自己的实验操作无误，比值1.3多也能RT成功，PCR做出很漂亮的条带来
  OD值受很多因素影响，它的比值不如参考书上的那么标准，并不能完全代表你的实验结果不好
  ......
  
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  谢谢您的意见！
  我在看到OD260/280比值不理想后就停在这里了，一直反复找原因，重复试验，确实没再往下进行过。或许我该先做到最后试试看。呵呵，谢谢了！

• 33号 (2016-4-09 10:38:59)

  我提的PNAOD 值一直都比较高 ,多数在2.0-2.1之间, 太高了也不好吧?我是拿DEPC水融RNA的, 也用来调零

• kulee (2016-4-09 10:39:16)

  
  我用比值为1.2的来做RT 也能做出来 所以我认为比值关系应该不大 不用太在意 做出来就可以了

• zzzz (2016-4-09 10:39:40)

  今天也做了第一次
  浪费了好多试剂和时间，幸好最后还是有点结果：反转录的cDNA可以扩出阳性片段，目的片段却没出来

• 911 (2016-4-09 10:39:55)

  
  可能跟DEPC水的灭菌有关吧

• u234 (2016-4-09 10:40:27)

  核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适，偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染（比值小于1.7）、RNA中有机物如氯仿等污染（比值小于1.7）造成。值得注意的是：当样品中的脂肪含量较高，而使用的抽提方法又没有特别注意这一点时，比值也会偏低。DEPC水有影响，但不是根本性的问题。RNA的质量及浓度以在胶上鉴定为使用前的最终标准，以rRNA条带尖锐（sharp）且28S的亮度是18S的亮度的2倍以上为好。另外，不同组织、不同的RNA提取方法所得RNA跑胶时rRNA的条带数可能并不仅仅是28S和18S这2条，可能还有较大的条带，但与DNA的污染又明显不同，它们与点样孔的距离较远。一般来说，这样的RNA样品可能质量更好。

• 8princess8 (2016-4-09 10:41:05)

  QUOTE:

  原帖由 u234 于 2016-4-9 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适，偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染（比值小于1.7）、RNA中有机物如氯仿等污染（比值小于1.7）造成。值得注意的是：当样品中的脂肪含量 ...

  到底是A260/A280值大于2.0有蛋白质污染还是有核算污染

• 黄花菜 (2016-4-09 10:41:20)

  
  感觉关系不太大，关键是蛋白浓度比较高，应该是氯仿抽提的不好