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【求助】总RNA提取

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-4-09 10:52    作者: yysr238    来源: 分析测试百科网

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【求助】总RNA提取
我最近在提取肝细胞和心肌细胞的总RNA，肝细胞是用骨髓干细胞诱导的
提取方法是用trizol提取
大致的步骤是：
1.在1个六孔板中加入1ml，trizol，吹打，吸取液体到EP管中。
2.加200ml氯仿，震荡30s，放置3min。
3.离心15min，10000rpm。
4.取上清加入等体积异丙醇。
5.离心10min，11000rpm
6.倒掉EP管中液体，加入75%乙醇。
7.离心5min，7500rpm
放在超净台中，鼓风干燥
加入10ul，depc水
然后取2UL,稀释到500ul，放在紫外中检测，检测结果260/280比值在1.3左右
但是电泳结果，三条带都有的，背景也是比较干净的
不知道260/280的比值这么低是什么引起的，需要怎么解决，谢谢大家的帮组！
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【求助】总RNA提取

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最新回复

  • 9900 (2016-4-09 10:52:31)


    和我成功提取的各步骤进行对比分析：
    1. 加trizol前PBS是否洗涤，去除死细胞
    2. 震荡时避免应用斡旋振荡器，以防破坏RNA全长
    3. 4度离心15分钟，12000g/分
    4. 取上清（一定要小心，避免枪头碰到下面白色层）
    5. 4度离心10分钟120000g/分
    6. 上下颠倒使rna块悬浮，洗涤rna块
    7.离心5min，12000g/分离心
    8.倒掉EP管中液体，一般情况下，放置一会，肯定会有较多剩余乙醇，小心用枪头吸出，用不着非得等到干燥（个人意见）。
    9加30ul DEPC水稀释
    你的OD值低，是不是第4步吸上清时碰到白色层，受到蛋白质污染了

  • yysr238 (2016-4-09 10:52:52)

    QUOTE:

    原帖由 9900 于 2016-4-9 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    和我成功提取的各步骤进行对比分析：
    1. 加trizol前PBS是否洗涤，去除死细胞
    2. 震荡时避免应用斡旋振荡器，以防破坏RNA全长
    3. 4度离心15分钟，12000g/分
    4. 取上清（一定要小心，避免枪头碰到下面白色层）
    5. 4度离心10分钟1200 ...
    不会的，我吸取上清的时候每次都是贴着壁下去的，而且每次都省一点没有吸取。
    我估计是不是我浓度太低的原因，请问你测的时候浓度都是多少。

  • 9900 (2016-4-09 10:54:22)

    QUOTE:

    原帖由 yysr238 于 2016-4-9 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    不会的，我吸取上清的时候每次都是贴着壁下去的，而且每次都省一点没有吸取。
    我估计是不是我浓度太低的原因，请问你测的时候浓度都是多少。
    我一般不会贴壁吸上清的，因为我发现离心完之后，中间白色层会贴壁很高，很容易就碰到，所以都选择在液面中间吸
    我的浓度一般是1ug/ul左右

  • yysr238 (2016-4-09 10:54:43)

    QUOTE:

    原帖由 9900 于 2016-4-9 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    我一般不会贴壁吸上清的，因为我发现离心完之后，中间白色层会贴壁很高，很容易就碰到，所以都选择在液面中间吸
    我的浓度一般是1ug/ul左右
    谢谢，我今天按你的方法提了一下，发现260/280的比值是上去了，但是好像浓度很低啊
    大概只有0.1ug/ul的样子！

  • 8princess8 (2016-4-09 10:55:01)

    浓度低会不会是细胞量变少的缘故呢？我在做的一个药物浓度大时对细胞生长有影响的，结果在提RNA的时候白色沉淀几乎看不出来！而阴性对照组和低浓度组就是肉眼可见的白色沉淀。测RNA浓度发现药物浓度大的那组浓度也是十分低的。我想，会不会是你PBS洗涤时损失了很多细胞？因为本来六孔板中的一空也长不了多少细胞。你可以每组养两孔试试，或是直接用培养瓶养

  • yysr238 (2016-4-09 10:55:19)

    谢谢啊，现在提取的RNA 260/280，已经符合要求了，但是浓度依然很低，260/230比值还是比较低的，我想问一下，你们一般6孔板能提取多少RNA

  • join (2016-4-09 10:55:40)

    蛋白污染了

  • 9900 (2016-4-09 10:56:01)


    1 单纯说6孔板信息是不全的，你的细胞长满一个6孔板的密度有多少决定了总RNA的多少。
    2 RNA得量过少不排除提取过程中被降解的情况。防止RNA酶污染的方法是：
    （1） 尽量用DEPC水浸泡可能用到的所有EP管，镊子，枪头等
    （2） 提取过程中勤换手套，薄膜手套效果差，最好用橡胶手套。
    （3） RNA酶除了存在于皮肤上等，还有说话唾液等，尽量少开口。
    （4） 再次核实到底6孔板长满时有多少细胞量。
    3 OD值低的原因上面战友说了很多，再提几点
    （1） 关键步骤一：加氯仿后颠倒混，不要用涡旋振荡但要用手用力颠倒。
    （2）关键步骤二：4度，20分钟离心的那步其实最关键。
    祝你顺利！

  • 9900 (2016-4-09 11:03:35)

    用DEPC水溶测得的比值比较低，用TE(ph=8.0)溶RNA所得的比值可以高一些，提得好的化可以达到1.9~2.0

  • wanglaoshi (2016-4-09 11:03:48)


    你的 异丙醇沉淀多长时间？

  • F22 (2016-4-09 11:04:05)


    离心这一步，我注意到你用的都是rpm
    可能是你的离心速度不够，自己把离心换成g，
    看看你的实际离心速度到底是多少g？

  • 18883920621 (2018-9-24 18:52:52)

    同请教，加入氯仿离心后，有乳白色中间层附着在上层管壁上如何处理

  • 18883920621 (2018-9-24 18:52:54)

    同请教，加入氯仿离心后，有乳白色中间层附着在上层管壁上如何处理

  • 13775112843 (2019-12-25 13:32:25)

    有用过试剂盒吗？针对RNA提取的盒子，我师兄用过BIOG的细胞RNA提取试剂盒，A260/A280是2.0，浓度也还可以

  • 13775112843 (2019-12-25 13:32:25)

    有用过试剂盒吗？针对RNA提取的盒子，我师兄用过BIOG的细胞RNA提取试剂盒，A260/A280是2.0，浓度也还可以

  • yhtfyl (2023-2-24 07:32:01)

    感谢楼主分享，受教了
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