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浅谈蛋白磷酸化位点鉴定
小弟做过两年蛋白磷酸化位点鉴定,现在在家里上网,手边没有文献,边想边写,谈谈点个人看法:浅谈蛋白磷酸化位点鉴定
1.蛋白的可逆磷酸化在生命过程中,特别是信号转导过程中那是相当重要,地球人都知道,我就不多说了:
1992年诺贝尔生理或医学奖授予给了Edmond Fischer 和 Edwin Krebs
"for their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism"
[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:38 编辑 ]
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浅谈蛋白磷酸化位点鉴定
浅谈蛋白磷酸化位点鉴定
最新回复
longcz (2007-11-08 18:28:50)
fischer.jpg
krebs.jpg
[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:03 编辑 ]
longcz (2007-11-08 18:38:37)
在很久很久以前,呵呵,也就是在质谱技术用来鉴定蛋白磷酸化位点前,想知道一个蛋白的磷酸化位点是很痛苦的,大多用P32或者点突变的方法,不仅费时费力,灵敏度还不高,巨痛苦无比。生物科学家们做梦都想怎么能又快又好的鉴定磷酸化位点呢?
3. 平地一声春雷响,生物质谱技术诞生了!
简单的讲,磷酸化会导致+80Da的分子量差异,通过测定这个差异,就可找到具体的位点了
phos.h1.gif
[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:04 编辑 ]
snow_white (2007-11-08 18:48:09)
然后,点击“插入”。
请见“在帖子中如何上传图片”
[ 本帖最后由 snow_white 于 2007-11-8 18:49 编辑 ]
longcz (2007-11-08 18:55:49)
http://bbs.antpedia.com/viewthread.php?tid=452&extra=page%3D1
于是先谈谈一下用质谱鉴定蛋白磷酸化位点的难点和解决方案
1) 磷酸化蛋白的化学计量值很低。生理条件下,蛋白一般不会100%的磷酸化,所以,只有部分的位点被部分磷酸化,于是蛋白酶解后得到磷酸化的多肽就不会太多,
由于带负电,常用的胰蛋白酶常酶切效率不高(因为它酶切位点是带正电的Lys和Arg)
要命的是磷酸化的多肽在离子源的离子化效率也不高(可能和带负电有关)。更要命的是,非磷酸化的多肽还会抑制磷酸化多肽的信号,这样几步下来,得到的磷酸化就更少了
解决方案:
A. 在负离子模式下检测磷酸化的多肽
B. MALDI-TOF中可以在matrix里加入磷酸,帮助磷酸化的多肽的离子化
C. 预先分离和富集磷酸化的多肽
在实际工作中,预先分离和富集磷酸化的多肽用得比较多
[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 19:43 编辑 ]
longcz (2007-11-08 19:05:52)
预先分离和富集磷酸化的多肽的具体方法
1).利用磷酸基团带负电分离
A)常见的有IMAC技术:immobilized metal affinity chromatography.IMAC是前几年选择性分离和富集磷酸化肽最广泛的方法。键合在螯合底物上的带正点的金属离子(Fe或Ga,Zn等)选择性地与磷酸化肽中的磷酸通过电荷作用部分相结合,并且在高pH 或磷酸缓冲液中磷酸化肽可以释放出来。
优点:每一个可溶磷酸化肽,不管其长度如何都能被富集,而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP—HPLC分析可以高通量的分析。
缺陷:非特异性结合较多,比如含有较多酸性氨基酸D和E的也可能被富集
不能与IMAC相结合的磷酸化肽和难于洗脱的磷酸化肽可能会丢失。
B) TiO2富集,这个方法是最近常用的新方法,可能成为主流,后面再重点讲讲~
C) 离子交换色谱,简单的讲,单磷酸化的多肽会比普通多肽少带一个正点(被磷酸基团屏蔽了),收集阳离子交换色谱中的穿透峰可以部分富集磷酸化的多肽
[ 本帖最后由 longcz 于 2007-11-8 20:00 编辑 ]
Neo (2007-11-13 09:09:59)
czs2001127 (2008-4-13 19:36:44)
amywang (2008-4-27 10:14:04)
fleame (2009-8-04 15:57:39)
gf_dtc (2009-9-28 13:59:59)
老毒物 (2009-9-28 23:26:59)
mycoin (2009-12-21 09:06:39)
ghcseu (2010-5-09 23:10:04)
英女侠 (2010-5-20 08:54:20)
浅谈蛋白磷酸化位点鉴定