[讨论帖]细胞损伤模型

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• 一叶 (2012-2-09 13:02:33)

  体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）
  
  　1　大鼠肝细胞的分离和培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
  
  　　将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
  
  　2　CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
  
  　3　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
  
  　4　检测指标
  
  1  AST、ALT的测定　培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性，结果以U·(106 cell)-1表示。
  2  肝细胞增殖试验　采用MTT比色法。
  
  3  肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定　先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3。结果以U·(106 cell)-1表示。
  
  4  肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定　先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(106 cell)-1表示。
  
  5  数据处理　数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

• 一叶 (2012-2-09 13:04:13)

  再发一个体内肝损伤模型（酒精）
  
  一、材料　纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。
  
  二、方法　将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。
  
  三、主要指标检测
  
  （一）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等。
  
  （二）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。
  
  （三）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度

• mamamiya (2012-2-09 13:04:39)

  
  请教各位大侠一个问题：想做过氧化氢致细胞凋亡的模型，查过一些资料说过氧化氢可以导致细胞凋亡，可是我做出来的流式细胞计数（PI单染色）图形象是坏死峰，亚二倍体峰离G1峰距离太远，老板认为过氧化氢导致细胞死亡就是坏死，与浓度没有一定的关系，肯定不是凋亡，我现在进退两难。
  哪位做过这方面的实验啊？过氧化氢致ECV－304凋亡的浓度及作用时间是多少啊，到底能否导致凋亡吗？能否提供一些可以导致凋亡的证据啊，也好帮我说服老板让我继续实验啊！谢谢

• 一叶 (2012-2-09 13:07:16)

  
  H2O2当然可以导致细胞凋亡，不过剂量掌握不好就变成细胞坏死了。
  
  检测细胞凋亡还是坏死是有方法的，建议你用pI ；dapi双染，请仔细查看本版的帖子。这样你老板就没话说了。
  
  H2O2导致细胞凋亡的主要原因是氧离子导致细胞损伤，包括DNA损伤。
  
  剂量需要做预实验，增加摸索。

• mamamiya (2012-2-09 13:07:42)

  唉！就是不幸啊！老板太固执了！
  
  坚持让我做DNA－ladder，只有出了ladder他才会承认是凋亡
  
  现在我只有拼命在跑ladder啊！

• ffooll (2012-2-09 13:08:03)

  
  想请教各位高人：细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型，我们学校的条件有限，只有三箱培养箱，没有那种缺氧罐，而三箱的氧浓度最低为1%，不能降到为0，而我看到许多国内的文献都用的是95%的氮气，5%的CO2，难道他们都有那种缺氧条件吗，并且如果考虑自制的话，还存在氧分压测量的问题，我觉得太复杂了，不知战友们都是怎么做的？不考虑化学缺氧。

• qumm1985 (2012-2-09 13:08:20)

  参考文献上说H2O2可以诱导凋亡,我用的是NEK52E,已经试过两次了,浓度设置是1-5mM,作用时间是1-2h.1h后观察,H2O25mM的细胞大片坏死,1mM细胞形态学也发生改变,细胞体积增大,很像坏死,用DAPI染色观察凋亡不明显(我照相了,等我拷过来就发上让大家看看).
  我想再试验一下,调整一下过氧化氢的浓度和作用时间,再就是用DAPI染色没法区分坏死和凋亡,可能要换一下方法.
  很希望与大家交流!

• 笑弯了腰 (2012-2-09 13:08:49)

  细胞模拟缺血再灌注诱导凋亡的模型其实就是细胞缺氧复氧模型，很有趣咱们遇到了相同的问题，前一段时间我还在研究如何将三孔培养箱用于缺氧实验，直到咨询了专业人士才恍然大悟，三孔培养箱和缺氧培养箱是两个概念，三孔培养箱的氧浓度调节是受限的，氧浓度设置应高于大气氧浓度，一旦氧浓度下降，氧源可以补充，开关培养箱门也不会对氧浓度有多大影响，这就类似于二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度的调控。但如果设置的氧浓度很低，用于缺氧实验通常小于1%，三孔培养箱实际上是无法达到这个条件的，设想一下反复开关培养箱门，培养箱内氧浓度肯定升高，但仍低于外界大气的氧浓度，如果没有一个负压抽气泵的话，怎麽可能使氧浓度降下来保持恒定呢？而真正的缺氧培养箱是具有一个抽气泵的，因此价格也要高的多。三孔培养箱则多用于特殊条件的培养，如高氧、高氮。
  至于缺氧的简易装置，我以前的帖子详细解释过，你可以看看，不要着急，自己动手尝试一下，祝成功。

• fqswdzd (2012-2-09 13:09:26)

  1.四氯化碳体外损伤肝细胞模型
  原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。(即熏蒸法)
  肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。（常用方法）
  
  2.醋氨酚体外损伤肝细胞模型
  肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。
  
  3.过氧化氢体外损伤肝细胞模型
  肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。
  
  4.氰化钾缺氧肝细胞损伤模型
  肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损伤。
  
  5.硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型
  肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。
  
  6.内毒素体外损伤肝细胞模型
  贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。
  
  7.半乳糖胺（GalN）体外损伤模型
  分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。
  
  参考《现代药理学技术》

• vivian4123 (2012-2-09 13:10:00)

  我现在也需要造大鼠肝细胞体外模型，可惜肝细胞用胶原酶消化下来以后就死了，有没有高手指点呀？我用0.03％胶原酶100毫升消化5分钟，灌流时未充氧气，0.4％台盼兰与细胞悬液1：1染色。用胰酶消化细胞活力倒是很好呀。

• loli (2012-2-09 13:10:20)

  
  研究药物对GalN所致WB细胞损伤保护作用的模型：
  1.将传代WB细胞以适宜密度接种于96孔板中，培养过夜。设对照组，给药组，模型组。
  2.吸去培养基，对照组加入溶剂对照，其它组加入含不同浓度药物的新鲜培养基培养1小时。
  3.模型组加入溶于培养基的GalN，终浓度为40mM。继续培养24h。
  4.MTT法测细胞存活率

• ero11 (2012-2-09 13:10:40)

  
  求助血管内皮细胞损伤模型

• DDD (2012-2-09 13:11:01)

  脊髓星形胶质细胞机械性损伤的体外培养模型
  1.材料与方法
  取新生的wistar 大鼠脊髓,剪碎,0125 %胰蛋白酶消化1h ,用含血清的DMEM培养液终止胰蛋白酶的作用; 而后吹打成散在的单个细胞,进行细胞计数,按5 ×105 个Pcm2 密度进行接种。培养至第10天时加10mM Leu2methy12ester 除杀小胶质细胞。于16d 时,用塑料吸管头划刮培养皿,产生三条宽约1mm长约1. 5cm 的损伤带,对照组未划伤,每组共分为7 个时间点,分别是划伤后0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h。
  
  2.观察指标：
  用免疫组织化学染色的方法分别观察划伤组和对照组星形胶质细胞中GFAP 的表达,进行半定量图像分析,
  
  3.对结果进行方差分析。
  
  4.结果
  从损伤后2h ～ 72h , 划伤组星形胶质细胞中GFAP 表达量与未划伤的星形胶质细胞GFAP 的表达量均有极显著性差异

• pengke1983 (2012-2-09 13:11:24)

  帕金森体外模型
  
  体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型
  l实验操作：实验采用胚胎龄14一16天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区。可将多个胚胎来源的组织收集在一起，置Fl2培养基（Gibco）至35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎。将2ml含0.125％的胰酶的F12加入到组织中，该混合物于37oC孵育10分钟后，加入DNase I（Sigma）至终浓度80ng／m1，继续于37oC孵育10分钟。消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次。该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基： MEM，补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml链霉素和7.5％胎牛血清）。细胞然后种植于35mm的预先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ug／ml merosin（Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为50,000细胞／cm2。培养16小时后，培养基换为无血清培养基。该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium，补充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氢钠，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰岛素， 100ug/ml转铁蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒酸钠（NaSe），30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素。
  毒物处理：于第4天以1uMMP+处理48小时。然后进行分析。
  模型评价：倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态。
  
  体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型
  采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5％CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次培养液。培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5％CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。

• pengke1983 (2012-2-09 13:11:46)

  Ａβ损伤模型
  
  取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞维持在培养液中，置入5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/Ｌ,以抑制神经胶质细胞的过度增殖,24ｈ后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验。
  
  也可以用PC12细胞株,常规培养
  
  Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：
  选择Ａβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol•Ｌ-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化处理并配制成所需浓度。（将Ａβ25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释，置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态）。
  
  细胞模型建立:加入浓度为20µmol/L的Ａβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.
  
  检测指标:MTT LDH 凋亡 细胞内钙离子 以及SOD等

• star#room (2012-2-09 13:12:18)

  人胃粘膜细胞的分离与羟自由基损伤模型的建立??
  王刚石 王孟薇 吴本俨?
  
  中国人民解放军总医院南楼消化科 北京市 100853
  项目负责人 王刚石?中国人民解放军总医院南楼消化科 北京市 100853

• 黄花菜 (2012-2-09 13:12:45)

  
  建立培养乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧(A/R)损伤模型和缺氧预处理(APC)模型:
  原代心肌细胞培养及APC模型的制作参照先前报道的方法[2]。即取出生后1－2 d乳鼠心尖部组织, 胰酶消化, 离心后用含20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液, 过滤, 按差速贴壁分离法纯化心肌细胞, 以1×105 cells/cm2接种于24孔板, 每24 h更换培养液。贴壁生长2 d, 于实验前24 h更换为无血清DMEM培养基, 随机分组, 每组双平行孔, 重复4次操作。缺氧/复氧(anoxia/reoxygention, A/R)模型的制作: 首先将培养基用N2在密闭容器中平衡1 h以上制成无氧培养基, 将培养孔中含氧培养基吸出后加入无氧培养基, 随后将培养板置于含5% CO2-95% N2 (V/V)混合气体的密闭容器中(37℃)进行缺氧孵育10 h, 此为缺氧操作, 然后更换为与O2平衡的培养基, 放回培养箱, 复氧孵育1 h。APC模型的制作: 预先给予1次2 h缺氧孵育, 24 h后按A/R操作。

• woshituzhu (2012-2-09 13:13:19)

  抑郁症的体外模型
  抑郁等精神疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降低造成的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,而且使神经营养因子表达升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征,其胞膜上GC受体表达丰富[6].本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态
  实验操作(MTT法测定细胞存活力)
  嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板,每孔10LL,放入CO2孵箱,培养3~4d,待细胞长满孔底后即可用于实验.参照文献方法,稍加修改,吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品),培养48h,吸去培养液,用D2Hanks液洗2遍,每孔加入含0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液,每孔加入10%十二烷基硫酸钠100LL,待蓝色颗粒完全溶解(约12~16h),用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值,用于定量反映活细胞数.

• HP007 (2012-2-09 13:13:44)

  
  关于血管内皮细胞我看过相关的文献，用LPS或是oxLDL都可以。大概的实验方法是：在培养板中培养EC至融合，加入LPS（具体剂量忘记了）或oxLDL（10-50ug/ml）共培养8－24h。

• one (2012-2-09 13:14:04)

  求助应用TNF干预人脐静脉内皮细胞损伤模型具体的剂量和方法。