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【求助】大家帮我分析分析我的WB啊！

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-6-04 17:25    作者: junjie05    来源: 分析测试百科网

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【求助】大家帮我分析分析我的WB啊！
大家好：
本人做了三个月的WB了，一直都做的不好，不只经常不出来条带而且最近新买了两个抗体做了好几次了居然都还没有出来过结果，很郁闷啊!古人云：磨刀不误砍材工啊！所以想把自己的条件及方法具体的拿出来让高手们看看出出主意。
我的目的蛋白是细胞因子IL-2,IL-6,TNF，分子量都是只有20左右。组织匀浆配方三去污裂解液加PMSF冰上裂解后离心12000转5分钟后100度水煮分钟变性，测蛋白浓度大致都为10微克每微升，蛋白上样50微克，2*的loading buffer，分离胶浓度为12％（水3.4ml，30％Ar/Bis 4ml，tris 2.5ml,AP100,10%SDS100,TEMED4)浓缩胶为5％(水2.7ml,30%ARr/bis670,tris 500,AP40,10%sds40,TEMED4)电泳80伏半小时后用100伏跑到溴分蓝快跑出来时停止电泳（我的溴分蓝总是跑的不是很直）。转膜用的时NC膜0.45的孔径，350毫安1个小时，后用脱脂牛奶封闭2个小时加一抗过夜，一抗用的是santa cruze的多克隆抗体浓度是1：1000，过夜后用TBST洗三次每次10分钟后加二抗浓度是1：10000，37度一个小时，再用TBST洗三次每次10分钟后，ECL发光，膜上全都是荧光不是成条带状的荧光，是一片一片的杂乱的荧光，没有条带。
谢谢各位高手帮忙分析分析，指点指点，感激啊！好人！

[ 本帖最后由 junjie05 于 2014-6-4 17:27 编辑 ]
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最新回复

  • xue258 (2014-6-04 17:25:29)


    先把另一块胶去染一下看一下胶跑得好不好，转完膜，又把膜染一下，看转得好不好，最后才是检查杂交的步骤。我也是做了3个月，现在都没结果，最后怀疑抗体出问题。花时间，给点耐性！

  • sunnyB (2014-6-04 17:25:45)

    因目的蛋白分子量只有20kd左右,故应用0.2NC或PVDF膜。

  • wmp1234 (2014-6-04 17:26:01)

    觉得一、二抗体的浓度有问题
    多摸几个梯度啊

  • 30moonriver (2014-6-04 17:26:22)


    1.蛋白提取后跑电泳时，可以做一个不变性的试试（摸摸条件，有时一抗识别的是蛋白质的二级结构，加热变性后就破坏了），我们曾经做过很多这方面蛋白的摸条件（如IL-8，不变性可以出来结果，而变性后就什么也没有了）；
    2.建议你的分离胶用15％的，这样跑得不会太靠下（当然这是相对的，与电压、时间有关系），底分子量的蛋白适合跑高浓度的胶，分离效果也好些；
    3.跑胶时，我们的方法是始终用一个条件跑到头(你这个可以用200v,50min就够了），带的效果可以，这个我们也是通过反复摸索得出的；
    4.转膜的电流有点大吧，可能会转过（而且你的nc膜的孔径比较大），建议150mA 2h试试；
    5.一抗和二抗的稀释液最好用封闭液，即你用的5％的脱脂牛奶，另外，二抗的浓度可以加大一点儿1：5000；
    最后，看看到底那步出问题了：像e992lmm说的那样，可以跑胶时，加几个平行样，跑完胶。拿另一半去染一下，看有没有结果，如没问题，再往下做；最后转完的NC膜发光后也可以再洗一下，用DAB染一下，看看有没有条带。如果有条带，就要考虑发光剂的问题了，如没问题，就要考虑你的一抗、二抗稀释的问题或者质量的问题了。
    失败乃成功之母！不要灰心，继续努力！

  • junjie05 (2014-6-04 17:26:38)

    非常感谢各位的帮助！你们的话给了我很大的鼓励啊特别是踏雪无痕这么仔细的解答真是很感动！还有两个问题想请教你：我的溴分蓝每次都跑的不是很直，气泡我都赶了的不小的是什么原因。还有就是我转膜后用丽春红染色后的条带都不是很浓也不是很清楚，有的清楚而有的就是红的一片，每次转膜后我都快没有信心继续往下做了，乌乌乌！用ECL曝光了肉眼就可以看到到处是荧光一托一托的荧光但是就是没有象条带状的荧光，用片子暴了都是黑乎乎的一片，不过ACTIN到是暴的还可以

  • PCR (2014-6-04 17:26:56)


    ACTIN表达量比较高，当然好出结果，顺便问一下你ACTIN用的一抗浓度是多少，我觉得可能你的一抗浓度还要降低。用1：500试一下，（如果你的ACTIN一抗浓度在1：5000以下的话，只是一个参考）
    顺便提一下，你做了这么长时间，你的样本是什么时候提的，你的提取液里的酶只加了一个PMSF是不够的，那样蛋白容易降解，你直接把蛋白跑个电泳，用考染试一下就知道了，我做过的。提取液里还要加NEUPEPTIN，APROTININ这两种酶。
    膜上杂乱的荧光太多，可考虑二抗多洗一会，洗个4～5次都没问题的

  • junjie05 (2014-6-04 17:27:27)


    我的actin的一抗浓度是1：1000啊，还要降低吗？我的样本是一个礼拜以前提了的，实验室的师姐们做好像都是没有加您说的这两种酶呢

  • PCR (2014-6-04 17:28:04)

    非常感谢各位的帮助！你们的话给了我很大的鼓励啊特别是踏雪无痕这么仔细的解答真是很感动！还有两个问题想请教你：我的溴分蓝每次都跑的不是很直，气泡我都赶了的不小的是什么原因。还有就是我转膜后用丽春红染色后的条带都不是很浓也不是很清楚，有的清楚而有的就是红的一片，每次转膜后我都快没有信心继续往下做了，乌乌乌！用ECL曝光了肉眼就可以看到到处是荧光一托一托的荧光但是就是没有象条带状的荧光，用片子暴了都是黑乎乎的一片，不过ACTIN到是暴的还可以

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    1.溴酚蓝跑得不直：可能原因有:一要胶没有充分混匀;二是有气泡；三是浓缩胶的宽度（跑胶的方向）可能有些窄，没有充分压缩；我觉得前两个原因是主要的，特别是第一个，加胶前要充分混匀，加样前要充分凝固（不要刚凝马上就加）。
    2.丽春红染膜后的问题：我觉得很可能与你的一抗是多抗有关，产生了非目的蛋白的干扰，封闭的时间也可以了，一抗稀释液最好也用封闭液，如果还是不行建议你最好买个单抗试试看。
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