【求助】50Kd蛋白做western的条件

最新回复

• kuohao17 (2014-6-07 09:48:00)

  
  湿转可用恒流100mA，2－3小时。具体可转几次marker看看

• fei1226com (2014-6-07 09:53:51)

  
  我做过220KD的,开始要摸条件.我是用100V的恒压,转了9个半小时,才转到膜上.但是在150以下的蛋白好象就已经转过了.

• nn255 (2014-6-07 09:56:19)

  
  我做parp，分子量是116KD，转膜条件是：湿转，80V，3小时，转的很好
  你可参考下，估计80V，4小时就够了

• zranqi_1 (2014-6-07 09:56:38)

  
  谢谢各位,浓缩胶和分离胶的配方能说来参考一下吗

• bamboo16 (2014-6-07 09:56:56)

  不同比例的浓缩胶有不同的配方，相同比例不同总体积的浓缩胶的配方也不同，具体有参考《分子克隆学实验指南》，现在已有第三版的中文版。150Kd蛋白western配方推荐如下，希望对你有所帮助。8％Tris－甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳总体积为10ml的浓缩胶的配方：水4.6ml，30％丙烯酰胺溶液32.7ml，1.5mol/L Tris（PH 8.8)2.5ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.006ml。
  Tris－甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5％分离胶4ml配方：水2.7ml，30％丙烯酰胺溶液0.67ml，1.0mol/L Tris（PH 6.8) 0.5ml，10％SDS 0.04ml，10％过硫酸铵 0.04ml，TEMED 0.004ml。

• zranqi_1 (2014-6-07 09:57:14)

  还有没有更好的啊，我想用7。5%和4%的胶跑，不知谁能说下配方

• wood533 (2014-6-07 09:57:32)

  7.5％Tris－甘氨酸SDS-PAGE电泳总体积为10ml的浓缩胶的配方：水3.5ml，30％丙烯酰胺2.5ml，1MTris（PH 8.8）3.8ml，10％SDS 0.1ml，10％过硫酸铵0.1ml，TEMED 0.008ml。
  5％分离胶4ml配方：水2.7ml，30％丙烯酰胺0.67ml，1.0M Tris（PH 6.8) 0.5ml，10％SDS 0.04ml，10％过硫酸铵 0.04ml，TEMED 0.004ml。

• wood533 (2014-6-07 10:03:55)

  
  我做120KD蛋白就用这个条件，很多文献也都采用这个，你可以先试试看

• JK.jon (2014-6-07 10:04:24)

  
  我做的目标蛋白有155kd,用分离胶10%和浓缩胶5%,湿转70v,4个小时,效果不错

• guagua (2014-6-07 10:04:54)

  我做的蛋白是90kd和72kd,请问高人，跑胶和转模的最佳条件是什么？分离胶和浓缩胶的浓度？谢谢！

• zranqi_1 (2014-6-07 10:11:56)

  你用 分离胶10%和浓缩胶5%电泳总共要跑多久啊
  我才70几的都跑了4个小时
  现在做150的想跑快点

• wood533 (2014-6-07 14:56:39)

  我是一懵懂的新手，初次涉及western blot，要做的目的蛋白分子量是140KD，求教各位高手，配胶的浓度和电泳电转的条件，可否施以援手，指点在下。

• ukonptp (2014-6-07 15:11:37)

  我做的蛋白是90kd和72kd,请问高人，跑胶和转模的最佳条件是什么？分离胶和浓缩胶的浓度？谢谢！
  
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  不是高人,共同学习,参考一下我们的条件,你自己在摸索一下:
  SDS-PAGE胶:5%积层胶,12%分离胶
  电泳:200V 1h
  半干转Sad若是pvdf膜须预处理) 150mA 2h
  这个条件也适用于hf0211 战友.
  有不少战友很注重分子量的大小和分离胶浓度的关系,其实我觉得分子量在170kd以下的蛋白都可以用这个条件(我们一直这样做,效果很好).
  另外,适当增加跑胶或电转的电压或电流(一般对结果影响不大),可缩短跑胶或电泳时间,可节约宝贵的实验时间.

• huifeng0516 (2014-6-07 15:11:58)

  一般情况下,浓缩和分离我大概用两个半小时左右

• ladyhuahua (2014-6-07 15:12:19)

  我做过200KD的蛋白转膜，电流100mA 1h,效果不错。

• zranqi_1 (2014-6-07 15:12:41)

  大家有没有试过膜上的条带很漂亮,但是染胶还是能看到蛋白条带呢?我有很多次都是这样,结果能反映出真实的差异

• mamamiya (2014-6-07 15:12:59)

  
  我若做130KD的 ，最佳胶浓度及半干转条件是什么？分离胶与浓缩胶需要不同的电压或电流条件吗？

• yonger (2014-6-07 15:13:19)

  我认为转膜的过程不能保证百分之百的所有蛋白全部结合在膜上,有一个比率的问题.但可以反映真实状态.实验的主要目的是比较同一块胶上的样品差异.因此可行.