【求助】IEF电压只有12V!!!一直不上升,大家帮帮忙

最新回复

• jujuba (2014-6-07 15:15:58)

  是不是 两极的滤纸没有压到胶条介质上？有时压的不紧也会升不上电压。

• yonger (2014-6-07 15:16:18)

  
  样品用试剂盒提的,根据试剂盒指示,样品可直接用于双向电泳.
  你又用旋转蒸发将其浓缩了一部分,再用水化液溶解了才上样的.
  仪器是GENOMIC SOLUTIONS的,设置为25000VH,9.5H,可跑了快一天了,电压仅仅有11-13V,根本上不去.盐离子用超滤的方法除了.以前盐离子浓度很高时,电压也有几百,不可能这么低.阳极滤纸有些变黄,胶条上的溴芬兰一点没跑.？？？？？你的具体问题我没搞明白？
  我建议可以检测电导率 总离子 不超过20mM 最好上样 一般不会有问题的
  加离子纸片 效果还可以 时间久点 据你所说的 应该是离子太多
  样品要用缓冲液置换好你的试剂盒提取得溶剂 同时你计算下离子的总数
  我具体不知道你的试剂盒是怎样的哦 ？是只提取蛋白呢？还是在提取的时候已经裂解蛋白了 只要你测蛋白质浓度 就可以直接上样 最多再加点两性电介质等等

• remenb (2014-6-07 15:16:36)

  好在看看你的电流的量，如果是电流也很小甚至为０的话，你就应该看看你的胶条是否受到破坏而引起的短路情况了！我遇到过这样的情况！我觉得其他的原因，比如离子的浓度一类的原因虽然可以导致电压升不上去，但电压不会象你的这样低，况且你用的还是试剂盒！

• 莲花白 (2014-6-07 15:16:55)

  
  我个人觉得,你的样品处理后是否还存在??应该在跑电泳前定一下上样量,如果没有问题,接着考虑上面各位所提的建议.

• jujuba (2014-6-07 15:17:16)

  
  我也出现了差不多的情况，我在IEF聚焦时电压也只有在2200－3000V左右，也一直上不去，就是不知道什么原因。一般来说聚焦过程中电压上不去就是因为样品中盐离子浓度太高，但是真核细胞应该没有多少盐分，而且我在裂解过程中也没有加入盐离子，请遇到过相似问题或知道怎么回事的大虾给点意见，我都快急疯了。
  具体参数：
  真核细胞
  7cm 胶条 PH3－10
  裂解液：7M 尿素，2M 硫脲，4％ CHAPS,1% DTT,5％ IPG BUFFER
  水化液：7M 尿素，2M 硫脲，2 CHAPS,1% DTT,5％ IPG BUFFER
  裂解方法:将贴壁细胞用生理盐水洗后刮下，离心后吸干上清，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，超声裂解，12000转离心，然后测蛋白浓度后根据上样量加入水化液再次12000转离心，在进行被动水化。
  IEF 条件：50V 1h
  150V 1h
  250V 1h
  500V 30min
  1000V 30min
  8000V 2h
  8000V 25000vhs
  但是聚焦根本到不了8000V，做了几次都只在2500V左右就上不去了，同时电流也下不来，在50uA,请各位帮帮忙看看！

• xyw5 (2014-6-07 15:18:03)

  将样品丙酮沉淀后再用2D buffer溶解

• IAM007 (2014-6-07 15:18:21)

  生理盐水洗下来后，离心吸干上清？我觉得上清吸不干的，然后，你裂解液加的有多少微升呢，加的少了残余的盐离子可能也会有影响的

• 婴儿脸 (2014-6-07 15:18:45)

  将裂解液和水化液中IPG buffer含量由“5％ IPG BUFFER”调整为0.5%试试。
  我曾经用过2%升压上不去，后来打电话问amersham技术支持，回答说推荐有2%和0.5％两个配方，但2%慎用！！！我不知道你为什么敢用到5%？那盐离子浓度肯定过高了，试试0.5%吧，祝好运！！！

• fei1226com (2014-6-07 15:19:05)

  
  你仪器有问题把 我猜的话