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【求助】蛋白纯化出现问题
【求助】蛋白纯化出现问题
最近,我用pET-32a载体表达25KD的蛋白,载体本身20KD,经鉴定目的蛋白存在于包涵体中,在纯化过程中,先用pH为8.0的8M尿素,0.1MNaH2PO4,0.01MTris-cl超声破碎15min,本以为再用pH梯度将目的蛋白最后洗脱下来,可是发现目的蛋白基本没有挂柱,而又用抗HIS的一抗做WB发现也没有问题,但就是目的蛋白不与镍柱结合,镍柱为Novagen公司,柱子本身应该没有问题,可问题出在哪一步,敬请各位高手指点迷津,急切盼望中.....
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最新回复
IAM007 (2014-6-08 16:41:31)
要是确定目的蛋白在包涵体内，可以用非变性buffer重悬菌体，超声波破壁，收集沉淀，然后用尿素变性。避免一上来就用尿素的话，很多本来可溶的蛋白也混进来。
HIS-蛋白 挂柱后，用含高浓度咪唑的buffer洗脱蛋白质。
taoshengyijiu (2014-6-08 16:42:44)
IAM007 (2014-6-08 16:43:15)
QUOTE:
实在抱歉，我前面的帖子回答是有问题的。1
首先要确定的问题是，蛋白质是没有挂柱还是没有洗下来，用 SDS-PAGE 检查每一个步骤。
2
用下面的buffer 洗柱：
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris·Cl
8 M urea
Adjust pH to 5.9 using HCl.
假如蛋白质是多聚体，复合物，双 His tag ，结合牢固，则可以使用下面的 buffer
100 mM NaH2PO4
10 mM Tris·Cl
8 M urea
Adjust pH to 4.5 using HCl.
pH 一定要在使用前调节。
3
最后，我始终认为，应该先收集包涵体，去除细胞裂解产物中的可溶成分以后，再用尿素溶解。
u234 (2014-6-08 16:43:37)
绝对是不挂柱,ph7.8结合后蛋白很多都下来了,不过我确实是直接用8M UREA直接裂解菌体,没用其他非变性液,而且是不是超声时间也不太够
jingling845 (2014-6-08 16:44:24)
8princess8 (2014-6-08 16:44:49)
ladyhuahua (2014-6-08 16:45:29)
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首先看一下你的上柱前是否有蛋白，我觉得你的超声强度不够，而且你没有一个溶解包含体的过程，可能蛋白没有完全变成可溶性的。还有你要仔细阅读柱子里面的说明书，严格按照说明书操作。
ladyhuahua (2014-6-08 16:45:47)
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咪唑可以洗脱可溶性蛋白。我也不建议使用PH梯度洗。尿素和咪唑没有什么影响，反正你纯化之后还要复性的，而复性多数是使用透析复性，那样绝大多数的尿素和咪唑都会被去除。
ladyhuahua (2014-6-08 16:46:03)
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如果仔细检查后尿素溶解还是不挂柱的话，那就用盐酸胍试试吧。
ladyhuahua (2014-6-08 16:46:56)
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好像不用吧，我是没有甚么特殊处理的，最多也就是为了跑胶效果好点，跑之前在沸水里煮一下了。
avi317 (2014-6-08 16:56:25)
上柱前有蛋白没有问题而且量也很大,ph8.0过柱后很多都下来了,到ph4.5时洗脱的蛋白不是很多.你说的超生强度不够是有可能,但我超声后液体已经很清量了,还需要增加时间吗?有个问题不太明白,你所说的没有溶解包涵体的过程是什么意思,我加入8m UREA不就是在融包涵体吗?
我准备换6m盐酸胍试试,那缓冲液还是用0.1mTRIS.CL和0.01mNaH2PO4吗,还有就是我如果不用ph梯度那用什么方法呢眯唑浓度吗,谢谢了,这么多问题真不好意思,呵呵
dog002 (2014-6-08 16:56:59)
QUOTE:
8M尿素是溶解包涵体的过程，但是溶解包涵体要一定的时间才能溶解完全的，我看你好像并没有溶解很长时间。
6M盐酸胍的配方我昨天不是给你了么？
20mM Tris-cl pH8.0
1mM EDTA
6mM DTT
是用咪唑梯度的方法洗脱蛋白。咪唑梯度自己摸索，从10mM到500mM逐渐增大，跑胶确定最佳洗脱咪唑浓度。
FOR YOUR REFERENCE ONLY
cwcwcww (2014-6-08 16:57:18)
我现在正在纯化融合蛋白，大小为24KD，载体是PET-28(+).我的纯化步骤如下（200ml菌液）：
1.用Buffer B裂解菌体，超声波破碎 （工作时间 2s 、间隙2s、终时间1min、功率400w），共2min。室温温和搅拌1-2h，避免有泡沫
2.12000rpm 离心20min-30min。收集上清液，同时取24ul上清液＋6ul 5x上样缓冲液，以备SDS-PAGE分析；用少量Buffer B裂解部分沉淀 ，也用SDS-PAGE分析，检测菌体是否裂解完全。
3. 用含有终浓度为1omM－20mM咪唑的Buffer B平衡Ni－NTA柱10min－30min
4. 除去柱子的底帽，收集穿透液，取少量以备SDS-PAGE分析。检测目的蛋白是否挂柱子。
5. 用含有终浓度为1omM－20mM咪唑的Buffer C洗Ni－NTA柱3倍柱体积，并收集若干superflow 以备SDS-PAGE分析。检测是否有目的蛋白洗脱。
6. 用BufferD洗Ni－NTA柱3倍柱体积，并收集若干superflow 以备SDS-PAGE分析。检测是否有目的蛋白洗脱。
7. 先用2ml Buffer E与Ni柱填料作用3-5min，除去柱子的底帽收集superflow ；再用4ml Buffer E与Ni柱填料作用3-5min，除去柱子的底帽收集superflow
再用6ml Buffer E与Ni柱填料作用3-5min，除去柱子的底帽收集superflow 。另取24ul所收集的样品＋6ul 5x上样缓冲液，煮5min－10min，－20度保存。以备SDS-PAGE分析。
8. 用250mM的咪唑洗脱Ni柱，收集若干superflow，另取24ul所收集的样品＋6ul 5x上样缓冲液，煮5min－10min，－20度保存。以备SDS－PAGE分析。
9. Ni柱再生。
wmp1234 (2014-6-08 16:57:38)
好像不用吧，我是没有甚么特殊处理的，最多也就是为了跑胶效果好点，跑之前在沸水里煮一下了。 ”
难道SDS不被盐酸胍析出。
2541 (2014-6-08 16:58:13)
高浓度的盐酸胍会和SDS起反应，跑不得胶。看到文献上面说过好像是用酒精洗涤后可以跑胶，但是具体方法忘记了。
我的意思是但凡提到包涵体就离不开复性的过程，那么完全可以复性之后才跑胶的，复性后盐酸胍的浓度就很低甚至没有了，这样不会影响跑胶了。
一向是知之为知之，不知为不知的性格，疏忽了，请见谅。
谢谢。
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