【求助】连接反应的问题

最新回复

• wawa (2014-6-09 17:49:40)

  
  我也怀疑我遇到了这种情况，是不是双酶切时不完全，导致载体自连然后转化到菌里了？

• join (2014-6-09 17:49:55)

  
  我觉得不仅仅如此，因为这样的话我们可以多挑几个斑，总会有的吧？不应该不长斑吧？

• 小鱼鱼 (2014-6-09 17:50:15)

  
  如果做蓝白班筛选应该比较快

• join (2014-6-09 17:50:51)

  
  我现在做回收都回收不好，因为我用试剂盒，他们的不好用，而且好像有人建议说，试剂盒能使一部分目的基因降解，且对粘性末端有一定影响，我就不用了，现在用酚氯仿抽提，可是两次了，都没有回收回来，我也不知道什么原因，因为我的片段有3000bp，应该很容易回收回来的～！◎

• redbutterfly (2014-6-09 17:51:11)

  
  如果挑的是空的话，可能是发生了载体的自连，你是不是没有设立对照呢，即不加目的片断，只用双酶切后的载体涂板子，如果对照也长了很多或者长的和你的实验板子差不多，那可以比较肯定的认为是发生了载体自连了。
  载体自连可能是由于以下几种原因引起的：
  1：载体没有切完全，
  2：转化时，载体和目的片断的比例不合适
  针对第一种情况我的经验是切载体的时候，载体的量放小一点；酶切时，酶一个一个的加，若还不行，就只好切两次了
  针对第二种情况，你可以在回收完之后，给DNA定个量，然后按DNA的量设计合适的载体和目的片断的体积，如果嫌麻烦，也可以在转化的时候将载体和目的片断以不同比例混合试一试。

• join (2014-6-09 17:51:27)

  
  谢谢，那要是不长呢，什么斑都不长呢?

• redbutterfly (2014-6-09 17:51:46)

  
  感受态有没有问题呢

• redbutterfly (2014-6-09 17:52:03)

  
  还有啊，你的目的基因和你的载体大小差不多，载体说明书上有没有提供该载体的最大容积呢

• join (2014-6-09 17:52:19)

  
  不应该是感受态的问题，因为我的感受态我重复过好几次了，也拿别人的感受态比较过～！我用的载体倒是没有注意倒这个问题，不过呢，同系列的就有人连接成功过，他跟我说没有问题，我也连上一个了，不过没有表达，现在正在测序呢，所以最大容积的问题好像不是影响因素啊！◎
  谢谢你啊，你做的是那个方面的呢？

• wood533 (2014-6-09 17:52:37)

  
  我感觉是你双酶切做的不好.
  如果是这样的话,给你的建议是把目的片断连接到T载体上,在双酶切回收.或者是PCR产物直接双酶切(这中情况你要考虑你的保护碱基的个数,不是所有的加两个都可以,最好是加到6个).

• join (2014-6-09 17:52:58)

  
  哦，保护性碱基我加的时候参考了很多，加了4个和5个，连到T载体上再切下来是不错，可是那样的话，因为我用的是PCUm-T,上面本来就有我的酶切位点，再连上的话不是具有相同的两个酶切位点了吗？那再切的话，就不能保证你要的目的基因 了啊？～！～！

• abc816 (2014-6-09 17:53:21)

  QUOTE:

  原帖由 join 于 2014-6-9 17:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哦，保护性碱基我加的时候参考了很多，加了4个和5个，连到T载体上再切下来是不错，可是那样的话，因为我用的是PCUm-T,上面本来就有我的酶切位点，再连上的话不是具有相同的两个酶切位点了吗？那再切的话，就不能保证你要的目的基因  ...

  这种担心是没有必要的，极少会发生你所担心的情况，再说你构建完表达载体后还要鉴定的。你遇见的这种情况最有可能就是因为PCR产物直接酶切不完全。建议你片段和载体的回收最好用胶回收的方法，直接抽提沉淀不能很好的去除酶切下的小DNA片段，影响连接效率。
  建议：
  1、PCR产物，胶回收，定量；
  2、回收片段与T载体相连，摩尔比3－10：1；
  3、转换，兰白斑筛选，PCR、酶切鉴定，并找一个或多个阳性克隆测序；
  4、双酶切测序正确的载体，胶回收目的片段，定量；
  5、胶回收双酶切的表达载体，如果两酶切位点很近或酶切体系相差较大，建议先用一种酶切，电泳检测后抽提沉淀，再用另一种酶切；
  6、连接片段与载体，最后做载体自连的对照和质量对照；
  7、鉴定阳性克隆。
  加上测序的时间大约两周吧！祝好运！

• abc816 (2014-6-09 17:53:41)

  
  刚才没有注意到你的片段有3kb，如果T载体和目的片段大小相当的话会比较难连！

• join (2014-6-09 17:53:58)

  跟T载体连接的话，如果用双酶切，那么这两个酶切位点是自己设计的还是载体上原来就有的啊？如果是自己设计的，那么如果载体上也有这两个酶切位点的话，不就冲突了吗，如果不用自己设计，而是载体上就有的两个酶切位点，那么在切的时候不就增加了一部分从载体上切下来的碱基序列吗？我不知道你能不能理解我说的意思～！还有你说的定量，怎么定量啊，不是大体上估计一下就好了吗？