【求助】明胶酶谱分析方法

最新回复

• wood533 (2014-6-10 16:19:53)

  QUOTE:

  原帖由 uuooii 于 2014-6-10 16:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  各位大侠：本人想做某肿瘤细胞明胶酶分泌情况，需要进行明胶酶谱分析的方法，但没有经验，有一些不明的，如所用的蛋白marker是不是与western blot 一样？实验所需的明胶哪家公司好？价格如何？ ...

  你的描述不够清楚。

• qianqin1977 (2014-6-10 16:20:10)

  
  
  这是我做课题明胶酶谱的步骤，借鉴一下。
  细胞培养及培养上清收集 按2.5×106细胞每皿，将HepG2-XB细胞及HepG2-HIS细胞分别接种至6cm平皿，培养24小时后以无血清DMEM洗3遍，以2ml含G418 400μg/ml的无血清DMEM继续培养，24小时后收集上清，离心去除细胞，上清冻存于-20°C备用；细胞以胰酶消化后重悬计数，以校正酶谱检测时各样品上样量。HT1080细胞以含10%胎牛血清的DMEM培养，至细胞覆盖约70%时，无血清DMEM洗3遍，以5ml无血清DMEM继续培养，24小时后收集上清，离心去除细胞，上清冻存于-20°C备用。
  2、明胶酶谱法检测MMPs的表达及活性
  （1）明胶溶液配制 称取10mg明胶，加入高压灭菌三蒸水，室温放置2h，使其吸水膨胀，然后置于65°C水浴，在15min之内溶成均匀的液体，最后定容至终浓度10mg/ml，于4°C备用。
  （2）SDS-PAGE胶的灌制 灌制10%SDS-PAGE胶，其中加入10mg/ml的明胶溶液，使明胶终浓度为0.5mg/ml。
  （3）电泳 上清与5×上样缓冲液以4：1混匀，加入10%分离胶，4°C、40mA电泳1.5-2小时，至溴酚兰达到末端。
  5×上样缓冲液: Tris-HCl(PH6.8) 0.4M
  SDS 5%
  Glycerol 20%
  Bromophenol blue 0.03%
  （4）2.5%Triton X-100清洗 胶置于100ml洗脱液中，摇床震荡1小时，以洗脱SDS，使蛋白质复性，每15分钟更新一次洗脱液。
  洗脱缓冲液： Tris-HCl [pH 7.5] 50mM
  CaCl2 5mM
  ZnCl2 1μM
  Triton X-100 2.5% (v/v)
  （5）孵育 胶置于100ml孵育缓冲液中，于37°C水浴缓慢震荡孵育40小时。
  孵育缓冲液： Tris-HCl（pH7.5） 50mM
  NaCl 0.2M
  CaCl2 5mM
  ZnCl2 1μM
  Brij-35 0.02%
  Sodium azide 0.2mM
  （6）染色 将充分孵育后的胶以双蒸水漂洗5分钟，重复两次，然后置于0.25%的考马斯亮蓝R250染液中，放在平缓摇动的摇床上于室温染色4小时。
  考染液： Methanol 45%
  Acetic acid 10%
  Coomassie R blue 0.25%
  （7）脱色 将染色后的胶置于脱色液中，放在平缓摇动的摇床上于室温脱色，每30分钟更新一次脱色液，至深蓝色背景上显出无色清晰酶谱条带停止。然后以双蒸水漂洗残留染料。
  脱色液： Methanol 45%
  Acetic acid 10%
  （8）扫描分析 将胶以Image Scanner（Amersham）扫描成像，ImageQuant TL V2003软件分析各酶谱条带灰度值，比较HepG2-XB细胞及HepG2-HIS细胞中MMPs活性的差别。
  3、胶原酶谱法检测MMPs的表达及活性 胶原溶液配制：称取10mg胶原，溶于0.3M醋酸溶液中，最后定容至10mg/ml，于4°C备用。其余步骤同明胶酶谱法。
  4、反向明胶酶谱法检测TIMPs的表达及活性 将5µg的Active-MMP2溶于1%SDS溶液中，终浓度为10µg/ml,冻存于-80°C备用。配制12%的SDS-PAGE分离胶，其中含明胶终浓度为2mg/ml，Active-MMP2终浓度为0.1µg/ml,孵育时间为24小时，脱色至看到无色背景中显出深蓝色清晰TIMPs条带，其余步骤同明胶酶谱法。

• uuooii (2014-6-10 16:20:44)

  
  我想请教一下，在用SDS－PAGE凝胶电泳时用不用蛋白质Marker,文献上都没说，那怎么知道做出来的条带是什么

• qianqin1977 (2014-6-10 16:21:13)

  可以用低分子量marker，但不可加还原剂。一般常用HT1080细胞（高表达MMP2，MMP9）上清做对照。明胶等试剂有些要进口试剂，也可用国产代替。

• uuooii (2014-6-10 16:21:36)

  我还有一些不明白的：1，SDS－PAGE电泳是不是分出分离胶和浓缩胶吗？但你的实验没有提及浓缩胶；2，SDS－PAGE浓度的选择：我看有些文献是用7.5%，有些用到12％，这对实验有影响吗？3，有些文献实验明胶终浓度为1mg/ml，有些描述是0.1%，到底以哪个为准？4，使用低分子量marker，为什么不加还原剂，我没有HT1080细胞，能否不以此作为对照呢？5，实验中所用的洗脱缓冲液和孵育缓冲液都是自己配制的还是可以直接购买的？

• qianqin1977 (2014-6-10 16:22:11)

  你好：
  1、SDS－PAGE电泳是分出分离胶和浓缩胶，灌浓缩胶可以不加底物明胶（当然也可以加），因为明胶凝固后形成网络状结构，不会随电泳而迁移；2、SDS－PAGE浓度的选择要根据我们要检测的MMP分子量的大小而定，一般MMP2、9的MW在90及70KD左右，因此用10％胶即可；
  3、明胶终浓度的不同是因为我们检测的样本MMP的含量有很大差别，若代检样本MMP的浓度较高，相应底物明胶浓度要高些，但检测灵敏度降低了，反之亦然，因此实验要摸索一下，既要检出差别，还要酶谱条带漂亮；
  4、加入还原剂后会扩散到其他泳道抑制MMP的酶活性，有低分子量marker可以不用HT1080细胞作为对照，但染色后marker往往被明胶遮掩掉，可用预染marker代之，并在电泳完毕后预扫描；
  5、洗脱缓冲液和孵育缓冲液都是自己配制的，开始很麻烦，做几次之后就很easy了。