【求助】关于膜显影的问题

最新回复

• tuuu2 (2014-6-11 16:29:05)

  
  可能是抗体太强了,将底物消耗光了,这样的话荧光会迅速淬灭而不再有光亮,所以胶片来不及曝光,建议将二抗稀释度提高,如1:3000或更高,或者增长洗膜的时间,应该可以解决你的问题,祝顺利!

• jujuba (2014-6-11 16:29:26)

  
  建议将一抗稀释成1：500，二抗稀释至1：3000以上

• koook5695 (2014-6-11 16:29:47)

  回楼上的 ，我曾经做到过一抗做过1；500 但是条带亮度又不够， 但是2抗浓度可能是有点高，降低2抗浓度有用吗 ？ 这方面的东西我听说的不是很高 还希望更进一步的指教 谢谢楼上 两位

• yjf1026 (2014-6-11 16:30:07)

  
  降低二抗有用的。
  条带不是很亮的话可以延长压片时间。

• koook5695 (2014-6-11 16:30:33)

  昨天晚上我做了个通宵， 一抗浓度依然是1；200 但是把总体积是4毫）4度过夜 2 抗浓度第一次做是1；3500 条带不错 显影时间大约有1分钟， 第2次做，转膜很好，一抗缩小为2毫升，室温2小时 （浓度不变）2抗也是室温两小时 但是没做出条带， 我很郁闷 ！！！以前一抗2小时能做出的， 只是我以前用的总体积是4毫升的 ， 我只改变了体积并没有变浓度啊 这个究竟是为什么啊》？

• fei1226com (2014-6-11 16:33:27)

  
  感觉你一抗二抗孵育条件太复杂了，按标准的室温1h就好了，这个条件对于完成特异性反应足够了，再长的时间只会增加非特异性的条带。抗体稀释度最好是先参照说明书，然后再稍加调整。底物发光时间短有可能是信号太强的原因，但你说只持续30秒是不是太短了点？另一个原因就是发光底物的问题了，我现在用的是pierce的，信号至少可以持续一小时。

• koook5695 (2014-6-11 16:33:45)

  
  我同学用我的发光盒，他的荧光强度很强，而且维持时间很长啊，他的2抗浓度用的比我还高啊。我的荧光真的只有几十秒就没了啊 连暴光都来不及啊 ，我好郁闷啊，还有所谓的室温是几多度啊 实验市开了空调温度也就是20多度吧 ，我抚育两个小时应该是差不多的吧 不会算长啊 ！！！我好烦恼

• vivian4123 (2014-6-11 16:34:49)

  QUOTE:

  原帖由 koook5695 于 2014-6-11 16:33 发表
  
  我同学用我的发光盒，他的荧光强度很强，而且维持时间很长啊，他的2抗浓度用的比我还高啊。我的荧光真的只有几十秒就没了啊 连暴光都来不及啊 ，我好郁闷啊，还有所谓的室温是几多度啊 实验市开了空调温度也就是20多度吧 ，我抚 ...

  从你的情况来看,应该是发光底物消耗得太快了,建议:
  1.减少蛋白上样量
  2.一抗1:500,4度过夜，二抗1:3500(或以上)，室温1h。
  3.加显色剂后如果肉眼能看到荧光，立刻把片子压上（此时一般只要几妙钟），应该能显影。
  如果几十妙后发光消失，可以再加发光液。
  祝好运！

• koook5695 (2014-6-11 16:35:12)

  
  对了 我还忘记说了 我按照没光了再加发光液做过了，第一次光比较强，然后再加就没光了，诶//////