【求助】western blot遇到的问题？

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• iii_ii (2014-6-14 15:27:41)

  
  希望大家能尽快给我方法，我看了 里面的很多贴子，但没有好的解决办法。 我去年一直跑得很好， 今年突然出现了这种情况。
  在积层胶里跑的还可以，一到分离胶就样品弥散，很宽的条带，而marker 红带以后就不能进入分离胶（15%），我试了10% 分离胶可以进入，但弥散很宽的带， 重配了三次缓冲液，而且前天换了一个新的电泳仪 ，我用的是Bio-Rad公司的。
  急需帮助阿！！！

• iii_ii (2014-6-14 15:28:11)

  
  都一样没 ，什么都没有变，就是10%的分离胶，但跑出来都非常弥漫，条带特别的宽， 急啊

• NBA (2014-6-14 15:28:32)

  
  弥散的条带非常宽，可能是你上样量的总体积比较大。你试一试增加蛋白的浓度，减少总的上样蛋白的体积。
  还有就是看看你的loading buffer是否有SDS的沉淀，如果用的时候没有好好溶解loading buffer沉淀比较多的话，电泳的结果也会比较弥散

• iii_ii (2014-6-14 15:28:57)

  
  用LoadingBuffer +DTT后煮沸，然后我每次都12000rpm 离心5分钟，所以不应该是Loading buffer的问题，以前我一直都用。 上样的量不大，
  今天我又把以前配的30%PAA 用滤纸过滤了一下，又跑了一次， 15% 的胶，结果仍是Marker 红条带72kda以后的跑不开，而且跑进分离胶的那几条Marker条带，到最后都快看不清了 ，原来重来没有这种想象。marker都可以跑进分离胶去， 请大家帮个忙阿 ，

• iii_ii (2014-6-14 15:30:03)

  
  电压我也改变了，从80，100，120，150，200，都试过了，就是不行。
  10% 的胶倒是可以把marker跑进取，但非常宽的条带

• iii_ii (2014-6-14 15:30:32)

  
  出不来，出来就无所谓好坏了，我可能蛋白也下不来，好像是修芬兰和蛋白分开了，修芬兰早就跑得很远了

• ladyhuahua (2014-6-14 15:31:04)

  配胶的所有溶液都重新配一遍可能可以解决问题

• bring (2014-6-14 15:31:51)

  
  我不敢确定，但从我个人看来问题应该还是出在聚丙烯酰胺凝胶上，跟别人借点试试，光过滤我看不能完全解决胶内部聚合问题。

• iii_ii (2014-6-14 15:32:15)

  
  但分离胶跑得很好啊 ，这就不能说是聚丙烯酰胺凝胶的问题，真烦人

• kuohao17 (2014-6-14 15:32:37)

  你是不是把每一个进样孔都加样品了，如果没有请将空余孔，尤其是只有两三个样品时，周围的几个孔加上Buffer液。还有，分离胶配好后是否立即用水压平？这步也很重要。

• iii_ii (2014-6-14 15:32:58)

  你好，谢谢你的解答，但你说的我都注意到了，我硕士就做了近一年的Western blot ， 现在又做了一年多， 发生着问题， 搞得我实在没办法，。各位智者，专家，快解答阿

• iii_ii (2014-6-14 15:33:14)

  marker应该不会有问题，因为一直都用的同一支marker 。关键　不仅是marker 红带跑不进去，而且是样品跑进去弥漫非常明显，跑到一定成都，根本看不清修芬兰了！

• zhenxin (2014-6-14 15:33:41)

  
  进入分离胶发生弥散现象，很肯能是你的分离胶的pH值有问题，你在重新配一下Tris-Cl

• kuohao17 (2014-6-14 15:34:05)

  我说的是marker的loading buffer有问题, 同理你目的蛋白的loading buffer也可能有问题了，因为loading buffer里有保持沉降的成分。其实溴芬蓝弥散不要紧，这只能说明 buffer中起沉降作用的成分明显不足，但这并不意味转膜后，蛋白也弥散。loading buffer只是引导蛋白的“先头部队”，它不代表后面目的蛋白“大部队”的不齐。

• iii_ii (2014-6-14 15:34:22)

  
  marker已经换了第三支了， loading buffer同样重配了三次，依然是那样

• 宁小胡 (2014-6-14 15:34:45)

  
  这种情况就是进入分离胶就开始扩散，最后跑得一塌糊涂的。
  当年我也遇到过。个人觉得应该是配置的溶液，下面的1.5mTisc有问题。你要用 pH来调的，有一种是不需要调的，直接配置完就到pH值。这种是不能用的。
  在配置试剂的时候一定要看清楚，有时候拿错东西而自己根本不知道，如果重复三次都一样错误，就要反思了。

• iii_ii (2014-6-14 15:35:04)

  根据我的经验，我觉得绝对应该是SDS的质量问题，SDS的质量好坏是影响条带弥散程度的最大因素，你应该换一下SDS,试一下吧！

• iii_ii (2014-6-14 15:35:24)

  
  SDS是去年卖的，一直都是用他的，以前就没有问题，难道ＳＤＳ放置时间长会变质吗？
  
  我觉得不是这个问题，因为我们一个人配，三个人在看，监督。不知道什么原因？

• iii_ii (2014-6-14 15:35:46)

  好的，是不是TEMED会有问题，因为我们原来用的完了，是去年别人剩下的，他们一直在室温下保存的，会不会有影响？ 多谢！！！

• iii_ii (2014-6-14 15:36:05)

  
  我觉得肯定是SDS的原因，因为我有几次跑的蛋白胶条带越往小分子去越弥散，后来我查了很多资料，结果发现就是SDS的问题，换了一个发现条带整齐尖锐漂亮！