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【求助】WB出现条带超多，不知该如何解决

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-6-14 17:08    作者: nikun230    来源: 分析测试百科网

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【求助】WB出现条带超多，不知该如何解决

1. 一抗是HRP标记，目标蛋白是65KD,做了三个稀释梯度1:2500,1:5000,1:10000.
2. 蛋白样品是TCA（人舌癌细胞）细胞，制备过程为：加2ml细胞裂解液（北京普利来公司产品）到一瓶（250ml）长满TCA细胞细胞瓶，滴管反复吹打，置4°裂解细胞5分钟，转移到1.5ml EP管，按比例假如loadding buffer，沸水中煮沸5min，离心取上清上样！
3. 浓缩胶80V,跑30min。10%的分离胶用100v跑1.5小时左右。转膜为湿转，300ma转1个小时，立春红S染膜能看到清晰蛋白带。
4.3% BSA 在4°封闭过夜，TBST漂洗3次，10min/次，上一抗（如1所述）室温（25°左右）低速摇床孵育2小时，TBST漂洗6次，10min/次曝光,显影，定影得到如下图结果。做了几次结果都相似，急死我了，请各位前辈多多指导呀！
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最新回复

  • glass (2014-6-14 17:08:43)

    就是非特异性显色的问题
    1、首先考虑减少二抗浓度，上文中我怎么没看见你使用二抗？
    2、减少曝光时间和显影时间
    3、加强封闭（增加BSA浓度或改用牛奶，我看你已经过夜了，时间应该没必要延长了 ）
    4、增强TBST洗脱 增加洗脱次数和洗脱时间 不过你已经6次了。。。
    并不是大问题，继续摸索一下就好了 别急Big SmileBig SmileBig Smile

  • dog002 (2014-6-14 17:09:04)


    Do you have to wash 3x10' after blocking?

  • 婴儿脸 (2014-6-14 17:09:24)

    是不是一抗有问题啊？？特异性不够，因此跟别的非特异性抗原结合产生多种条带？？有一次我做得也是出现很多这种梯装带，后来考虑还是没洗干净，你的TTBS加TWEEN20没有啊？？还要注意一下TTBS 的PH值！！我第一次做没调PH值后来再洗脱这步注意了调TTBS 的PH值，并且每次摇洗15分钟，洗3次，就再没出现这种情况！

  • glass (2014-6-14 17:09:44)

    首先不应该考虑一抗的事情，只有真的是无法调整了，才最后怀疑一抗

  • 33号 (2014-6-14 17:10:01)


    降低二抗的浓度，先别管抗体建议的稀释浓度

  • flower-201 (2014-6-14 17:10:21)


    The problem often lies within the specificity of the primary antibody, provided the blocking is sufficient. If you block with 10% NFDM and still get strong background, I would think the primary antibody is not good.

  • yapuyapu (2014-6-14 17:10:54)

    1、首先考虑减少二抗浓度，上文中我怎么没看见你使用二抗？

    ==============================================================================================================

    前文HRP直接标记在一抗上面，所以没有使用二抗系统。
    同意楼上战友观点，前文使用多抗，非特异条带难以消除，首推稀释抗体降低背景，也需压片技巧。
    前图中一抗1：10,000而且没有使用二抗系统，信号如此强大，甚至出现了几处反影（白色的小片中空影）请问是使用pg级的底物吗？我们ng级的底物一般没有这个本领把少许游离的底物也显示出来。如果是这样的话，10倍稀释抗体吧，如果还不能解决，可以在红灯下通过压片技巧解决。具体解释见文 ：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/5936631') 的注7即是。因为仅使用一抗系统（仅有1个变量，而没有二抗系统增加实验的复杂性），理论上可以通过降低抗体浓度解决背景高的问题。如果前文使用ng级底物，那么也可以通过稀释抗体解决背景。

  • 11_hjx (2014-6-14 17:11:15)

    我最近也被这个问题烦着，哪位前辈能指点一下么？
    转膜没有问题，但是只要gel上面有的蛋白带都有和抗体结合！我用的是anti-his HRP conjugates,只用一抗就可以了。我用的一抗浓度是1：4,000。

  • mogu (2014-6-14 17:11:35)

    把封闭液换成脱脂奶粉，BSA封闭效果并不是很好。我以前也有过类似的经历，用BSA封闭的膜曝光后黑乎乎的一片，换成5%脱脂奶粉就一切都正常了。此外，一抗直接标HRP并不推荐使用，因为如果一抗本身特异性不好就会造成高的背景值。如果可能还是建议用普通的一抗加上标记有HRP的二抗来完成试验比较好。

  • seagate (2014-6-14 17:12:12)


    TBST液还要求PH值的?!要调到多少啊?

  • nikun230 (2014-6-14 17:12:45)


    下图为用5%脱脂奶粉封闭过夜的实验结果，其余同！
    似乎样品有些降解，但我要的目的带（44k,42k，25k）仍未出现！高的蓝线是58KD,低的蓝线是18kd，急呀！各位老师多多指导！
    我的一抗是磷酸化抗体！


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  • wawa (2014-6-14 17:13:01)


    磷酸化抗体不推荐使用脱脂奶粉封闭，因为奶粉中含有磷酸酶！
    换封闭液应该能解决你的问题。

  • fox_79 (2014-6-14 17:13:23)

    BSA及牛奶对特异性检测的影响
    1 BSA及牛奶都含有磷酸化的酪氨酸，这给解释用特异性磷酸化抗体进行的实验造成的一定的混淆，可引起背景增高。如果BSA及牛奶都无法解决磷酸化的酪氨酸背景，那么可以尝试0.2%Tween20的PBST或0.2%的TBST，但因为Tween20的封闭能力不如BSA及牛奶，所以虽然躲过了磷酸化酪氨酸，但又可能残留的一些背景。
    2 BSA及牛奶也都含有生物素，也给生物素/链霉亲和素检测的应用带来一些问题。生物素/链霉亲和素作为二级水平检测（生物素标记于一抗上，链霉亲和素相当于二抗标记HRP，这个系统已广泛应用于ELISA），可以提高信号检测敏感度。
    3 某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶活性，给AP标记的抗体应用也有一定影响。

  • nikun230 (2014-6-14 17:13:45)

    TBST液还要求PH值的?!要调到多少啊?
    我很想知道这个的答案，各位告诉我，好吗？
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