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【求助】如何在Ecoli中表达真核生物基因
【求助】如何在Ecoli中表达真核生物基因
我用的载体是pET-28a(+),菌株是BL21(DE3)。靶基因来自植物,该基因相对于大肠杆菌来说,其稀有密码率为7%,且在5'端很接近ATG的位置即有出现。表达蛋白的理论大小为20kd。我表达了几次也没有表达出目标蛋白。我是这样做这个试验的:
1、融合蛋白质粒通过Call2转化法转入BL21;
2、将阳性菌液接种37度培养过夜;
3、第二天,按1:100将过夜培养菌加入10ml新鲜抗性培养基中,37度扩大培养2个小时;取出对照;
4、向剩下的菌液中加入IPTG至终浓度1mM,28度继续培养4h,8h,收获菌液;
5、用2X的sample buffer破裂细菌,煮沸,离心,取上清跑SDS page胶。
结果没发现靶蛋白的条带!真不知是何原因。
该实验为paper所必须,恳请各位帮忙,在这里先谢谢大家了!
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最新回复
了了 (2014-6-14 17:20:52)
为什么诱导后用28度,会不会是温度太低了。
huifeng0516 (2014-6-14 17:21:09)
换一下宿主菌,用Rosetta-gami(DE3),该宿主菌能提供稀有密码子。同时诱导时要做阳性对照,保证诱导系统没有问题。
zsxan1990 (2014-6-14 17:21:31)
最需要的是将宿主菌换成Rosetta-gami(DE3),解决稀有密码子的问题。然后试一下诱导温度,做个温度梯度看看。
BUK (2014-6-14 17:21:52)
不行就换个载体吧, 感觉用带GST tag de vector 容易表达的.
xevin (2014-6-14 17:22:11)
看过很多帖子,一般认为温度对表达的影响较大。我今天再表达试一下,如不行,就只好换个载体了。但不知Rosetta-gami(DE3)是那个公司的,常用否?
xevin (2014-6-14 17:22:44)
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有人说30度,37度均可,但也有人认为在25度表达较好。你用过这个表达系统吗?
yychen (2014-6-14 17:23:02)
1)整个实验流程没任何问题
2)改变诱导温度和时间于问题不会有质的改变,通常如果蛋白表达量过高形成包涵体后放在低温下培养,蛋白易于正常折叠而成可溶形式;若想蛋白表达从无到有,改变培养温度和时间,或者诱导剂的含量等几乎是"mission impossible"
3)蛋白表达不出的根本在于基因本身的问题,如你提到的稀有密码子偏多等原因;另外主要是转录的问题,如该原核启动子对目的基因不起作用等,因此改变的方法只能是换表达载体以及宿主菌
4)我最近表达了一个细菌蛋白,当时克隆的时候装了两个表达载体,结果其中一个表达量达到了总蛋白的50%以上,另一个则压根没表达,连western-blot都没信号,这种问题一般很难用原理来解释的,有时候只能碰运气了
xevin (2014-6-14 17:23:25)
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