【求助】his-tag resin 无法结合目的蛋白！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-6-17 18:23 作者: 079777chao 来源: 分析测试百科网

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【求助】his-tag resin 无法结合目的蛋白！

各位侠，小弟碰到棘手问题了，希望大家给点意见。
我是用毕赤酵母进行高密度发酵的表皮生长因子，发酵液离心后，收集上清，然后过histag柱，但是怎么样都结合不上去，跑sds－page时，看到虑过液中的目的蛋白非常多，跟上清的几乎一样，而洗脱液中量少的可怜，，只有很模糊的蛋白条带，wash buffer和bind buffer过柱后的液体检查没有目的蛋白
原因一定是没有结合上去
后来我把ph调到7.8，另外一批进行透析后上柱，结果还是不能结合上去，透析的目的蛋白也不见了
我自己分析一下原因，可能有几个1，his tag树脂不行，我用重生柱的，按照说明书进行（不知道大家用的是什么样的流程重生，我的是先用离子化缓冲液过柱，bindbuffer平衡后就加液体，采取了连续流过的方法，一次性过几十毫升）；2，上清中盐离子浓度太高，初步算了一下，达到0.4mol的盐离子浓度；3，目的蛋白分解，可能六个his部分有损伤，导致结合不上去。
大家有什么好的建议啊，指导可怜的孩子吧，呜呜

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yychen (2014-6-17 18:24:57)

1,也许填料的配基密度不够,或者作用力太弱,一般说来填料的颜色越深,配基密度越大,作用力越强,所以有时候选择强的就能挂上.
2.盐不影响吸附,除非是高浓度的铵盐,3,目标蛋白的标签不充分暴露,难结合,只能在变性条件下做看看.
NBA (2014-6-17 18:25:20)

除了您自己和c楼上战友提到的一些原因以外，是不是应该考虑蛋白降解的问题。
如果人家文献上有过报道的话严格按文献上说的做做看。
如果自己摸索条件，除了上面的建议，能否考虑加多种蛋白酶抑制剂比如PMSF、PepstatinA、Leupeptin、Aprotinin等？还有就是洗脱后马上煮样电泳看看（虽然有midazole不太好点，呵呵）
还好这个纯化过程不是很复杂，祝好运～
wmp1234 (2014-6-17 18:25:37)

根据我们实验室的经验，这种情况一般都是蛋白C末端降解造成的，因为Ni亲和纯化操作很简易，不太可能有问题。
lxh031 (2014-6-17 18:25:56)

将滤过液作Western看一下是否能够与抗His抗体识别就能判断是否有降解。
上样时一定要放慢流速以保证充分的结合时间或者直接在室温将凝胶与样品缓慢搅拌混匀，然后再上柱。
079777chao (2014-6-17 18:26:13)

谢谢各位提出来的好见解
有可能蛋白质降解造成的，因为发酵上清在四度放了两个多星期
还有，发酵的时候是用硫酸铵作外控制ph的试剂，同时作外氮源，有没有可能是氨的影响呢？
tangxin_80 (2014-6-17 18:26:32)

氨应该没有关系，因为你纯化前上清需要透析的。发酵液上清最好－20度保存，4度最多放置3－5天，酵母表达产物在上清中不太稳定的。
kuaizige (2014-6-17 18:26:48)

我们实验室的同学也曾出现过这种情况，当时用的是一瓶就的Ni柱，后来换了瓶新的就洗脱下来了！
niangao1980 (2014-6-17 18:27:17)

各位大侠，酵母上清在过HIS柱前需要做何种处理？最后怎样把蛋白换成溶解在BINDING BUFFER，听说这个buffer对结合很重要。最好详细些，我正在做，也还没结合上去。
DONT (2014-6-17 18:27:35)

可以先超虑，然后用binding buffer洗脱，我看到好几个文献都是这样做的，还有一个透析过虑系统，，不过，他们这个系统都是成套的，要一两万，要是有现成的就好了
要是单独的就有超虑杯，只要两千快，但是要连接氮气，和一个抽空泵
呵呵，我准备买一个成套的，正在找厂家呢