【求助】有关WESTERN BLOT的一个问题

最新回复

• plaa (2014-6-19 12:50:10)

  
  建议你最好剪开！防止非特异交叉反应，如果你觉得是ＭＡＲＫＥＲ就一个涌道的话，你可以在作完的时候在放在一起比对就好了！

• zhenxin (2014-6-19 12:50:33)

  
  最好不要这样，我刚开始做时也想这样，查了查好象说是加上二抗以后有交叉反应，要用二抗相应的动物血清封闭．要是有ＭＡＲＫＥＲ且目的蛋白的分子量大把膜剪开就行了．

• ssonglikihi (2014-6-19 12:51:03)

  
  我还有一个问题，如果跑胶时用的预染marker，目的蛋白的分子量是不是一定与预染marker的标示完全一致，会不会出现偏差。我的目的蛋白的分子量是72-74kd，marker的第二条带是79kd，而第三条带是46kd，我跑出来的蛋白条带是比较接近第三条带的，这可能是我的蛋白吗？还是非特异性反应？谢谢高手指教。

• dog002 (2014-6-19 12:51:21)

  
  一般来说,跑出来的蛋白会比原来预想到的大一些(可能于蛋白修饰有关)
  你的蛋白分子量是怎么查到的?
  文献中的会准一些,用软件算的话,就不是很准确了
  至于它是不是你的目的蛋白,杂交一下不就一目了然了!!

• ssonglikihi (2014-6-19 12:51:42)

  
  我的蛋白分子量是通过文献查到的，应该比较准确了。怎么杂交呢？具体怎么做能说得明白一些吗？谢谢帮忙！

• c86v (2014-6-19 12:52:14)

  
  你的蛋白不会在变性的时候亚基分离了吧？查查这个蛋白会不会存在二硫键连接的亚基~~~

• dog002 (2014-6-19 12:52:32)

  
  你做WB 不是有你目的蛋白的特异性抗体吗?
  转膜后一抗孵育2小时
  tbst洗3次,每次5分钟
  二抗孵育2小时
  tbst洗3次,每次5分钟
  显色就可以了啊!!
  如果是你目的蛋白的话,不就看到了吗?
  小一些的话也正常啊
  同意楼上的看法

• ssonglikihi (2014-6-19 12:52:49)

  请问你作Western是一天作一批样本吗？还是两天作一批？一抗孵育是恒温37度2个小时吗？我们实验室的同学都是室温一抗孵育4－5个小时。孵育两个小时时间够吗？

• dog002 (2014-6-19 12:53:23)

  我是两天作一批,第一天跑胶,转膜,然后封闭过夜
  第二天作杂交
  刚开始摸条件时是恒温37度2个小时,但是有杂交时,液体挥发问题解决不了,
  现在我们这室温也不是很低了(有时能到30度),就室温孵育2两个小时了,效果也不错,我还试过一抗在4度杂交过夜,也出了,我感觉杂交时间不是问题,只要抗体效价高,时间是可以考虑改变的.
  ps:室温杂交是也是用摇床在摇的.过夜的不摇,就是放冰箱里了