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【求助】看看我的2D胶，帮我找找原因好么？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-6-21 17:54 作者: xevin 来源: 分析测试百科网

为了能得到大家的更好的帮助，我把故事说的详细一点。
样品：组织分离细胞，大小与HepaG2细胞相似
方法：取7×10的6次方个细胞（如一粒米大小），加入1ml裂解液（6M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，40mM Tris，50mM DTT，抑肽素，亮肽素，PMSF，DNAse，RNAse）裂解细胞，冰上超声（超2s，停5s，共2min），28000g×1小时离心，取上清，定量为12mg/ml
上样：取25ul样品＋125ul水化液（配方与裂解液类似，缺少Tris，蛋白酶抑制剂和核酸酶）
电泳：7cm 3－10，4－7
50v水化12h
250v 30min
1000v 1h
4000v 3h
4000v 24000vh
500v 保持
平衡：按照bio－rad方案
6M 尿素，SDS 2％，Tris－Hcl 375mM，甘油20％
平衡一，每10ml＋0.2gDTT 15min
平衡二，每10ml+0.25g碘乙酰胺 15min
SDS-PAGE： 12％胶
初始电流：5mA/gel
加大电流后：16mA/gel
结束后：考染4h，脱色，扫描
上面的是3－10，下面的是4－7
最后感谢各位耐心的看完这个故事，请帮我找找胶的原因好么？

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【求助】看看我的2D胶，帮我找找原因好么？

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ending (2014-6-21 17:55:02)

我曾经做的材料是植物的，刚开始也出现过这种样式的图，应该是在聚焦的时候出现的你的点聚焦的不是很好！一般是盐离子的问题，寻找一些去处理离子的方法，比如过滤等，也有可能使提蛋白的时候或者第二向的时候蛋白发生降解，控制比较低的温度是必要的.另外请标明一下你的图的酸碱端以判断图的左端的成分！
xevin (2014-6-21 17:55:22)

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头痛
那后来您是如何改进的呢？聚焦不好是不是会出现横纹？现在让我头疼的是3－10中的纵纹。（两个图中，有很深的一道纵纹的位置为碱性区域）
xevin (2014-6-21 17:55:42)

两块胶是一起跑的，上样量也是一样的。
is2011 (2014-6-21 17:56:19)

自己顶一下，希望能得到帮助：
1：为什么3－10会中性区域会出现拖尾和纵纹
2：为什么4－7的点数不多
谢谢各位了！
linlinstar (2014-6-21 17:56:38)

首先,你跑IEF的时候能达到4000V吗?但是24000VH按理肯定是够了,你注意你的电流了吗?我觉得有可能是你的盐离子的影响!
xevin (2014-6-21 17:56:58)

能够达到4000v的，最近我又用同样的样品跑了一下
并用clean up kit纯化了一下，还是得到了同样的结果
不知道纵纹到底是因为什么
zbboom (2014-6-21 17:57:18)

一端的垂直条纹应该是样品出现聚集或者沉淀。a）稀释样品，在样品进行IEF前须对样品分析和定量，以确保正确的上样量。样品上样量通常和IEF时所选用的IPG胶条的长度和染色方法有关。
leifengta (2014-6-21 17:57:37)

我发表一下愚见：
1、可能你的蛋白有所降解，较小的片断或氨基酸在等电聚焦时堆积在碱性区域。
2、你仔细观察一下，有条纹的地方是不是等电聚焦时候电极所在位置。
3、我觉得你等电聚焦过头了。聚焦过头会导致电渗漏，会有很多条纹出现。我7cm的胶条只聚焦10000 vhr就够了。