【求助】可溶性表达，请高手帮忙

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• avi317 (2014-6-26 17:06:10)

  包涵体的形成到现在为止似乎没有谁能确定
  但目前我认为最有说服力的就是由于折叠太快所致，
  那么我们把重点放到表达速度上可能是最好的方法（当然如果能加入什么伴侣型试剂引导折叠能不能起作用就更不知道了）
  能降低表达速度的有什么呢？（个人认为)
  1,降低温度
  2，试着在不影响表达的条件下降低IPTG浓度（我们用的IPTG往往都是过量的），再把最低量改为流加，可以把IPTG配到培养基中流加.
  3。试着改造培养基把能导致其表达的因素全部改成流加不能使之快速利用
  最后，其实我觉得包涵体有包涵体的好处，我按照以上3点还真把蛋白从包涵体表达成可溶的过（极个别的成功）其实如果没有特殊需要，没必要，反而好纯化！

• 2541 (2014-6-26 17:06:30)

  
  我们实验室的一个蛋白质，开始时怎么弄都是包涵体，后来，改变了培养过程：
  1 菌落 ---〉 5 ml LB , 30 度 6 小时。 (pre-pre-culture)
  2 5 ml ----> 200 ml , 30 度 6 小时， 加入 IPTG 诱导。 (pre-culture)
  3 200 ml ----> 20 L ， 30 度，24 hours. (culture)
  我还不能解释其中的原因，但是这个方法的确对我们的蛋白质表达奏效，当然，这只是个案，不一定能解决楼主的问题，只是提供一种可能性，通过两次对数生长期前 的 前培养，前前培养， 使蛋白质可容表达。祝楼主好运。
  

• 箭头儿 (2014-6-26 17:06:57)

  你的蛋白有没有二硫键，如果有的话，在细胞质中是不能正确形成的，一定是包涵体形式，周质空间是氧化态势，可以正确形成二硫键，但实现分泌和提高表达还是有很多困难。
  如果没有二硫键，可以试着优化培养条件，但结果还是不理想的话，还是试一下融合表达吧，这样可溶性表达的可能性大一些了，比换载体与宿主要快一些。

• shenkunjie (2014-6-26 17:07:45)

  非常感谢大家，我想请问一下，具体流加的方法

• DONT (2014-6-26 17:08:05)

  
  再降低诱导温度，试试16度

• DONT (2014-6-26 17:08:24)

  
  我也是作可溶性蛋白表达的，一般来讲都是从包涵体的路走，复性也没有想像中那么难，多看文献，多动手，会成功的。