【求助】双向电泳中如何增加碱性区的蛋白质点

最新回复

• qqq111 (2014-6-26 17:22:05)

  
  我觉得你的图最大的问题可能就是图的横条纹很多，点也不是太齐整。重要的原因就是你的第二向的操作有问题：凝胶的时候上胶面不平或者是胶条与PAGE胶的胶面接触有问题！

• wawa (2014-6-26 17:22:23)

  
  我觉得问题应该是第一向等电聚焦没有聚好，所以才造成横条纹很多．而且图的上半部分背景深，而下半部分的背景浅，很可能与你第二向所用的琼脂糖有关．琼脂糖应每次新鲜配制，且浓度严格控制，浓度过高容易造成银染背景深

• zhezhe (2014-6-26 17:22:40)

  
  我觉得这次电泳一向二向都存在问题，一向蛋白没有聚集好，点不能很好的分开，血浆中高丰度的蛋白需要事先除去的。如果你已经除去了那蛋白上样量可以减少些。
  二向蛋白点也没有拉开，建议试剂等重新配过，你的胶质量不是很好，是不是配胶试剂不好啊，PH值对吗，我们双向一般都用进口试剂胶的质量还是很好的。

• skytree (2014-6-26 17:22:58)

  
  相关疾病：
  头痛
  谢谢各位！
  胶条转移一直是个头疼得问题，总是难以完全放好。可以提供具体的方法吗？
  琼脂糖的问题以前没有考虑到，可以改善一下看看。
  试剂是进口的，上次配TRIS时对酸度计的结果有点疑虑明天再测测PH值看看。
  另外，胶凝好后当日用好吗还是4度过夜的好？是不是看到折光界面就可以用了，大概距灌胶2小时。

• niangao1980 (2014-6-26 17:23:19)

  
  胶凝好后最好当日用!
  对于18或24CM的干胶条的PAGE胶，最好多凝一会！

• cwcwcww (2014-6-26 17:23:40)

  
  错，二向凝胶最好4℃过夜。SDS-PAGE倒没有严格要求

• orangecake (2014-6-26 17:23:59)

  楼主:
  能告诉我为什么吗?还有,你说的"SDS-PAGE倒没有严格要求"是什么意思?

• orangecake (2014-6-26 17:24:20)

  你认为这张图可能是"第一向等电聚焦没有聚好"的问题,这个问题的原因可能有哪些?应该怎么解决?

• cwcwcww (2014-6-26 17:24:41)

  
  一维SDS-PAGE胶大概2小时左右就能聚合完全，可以直接上样跑胶。但是双向的胶最好过夜放置，使其完全聚合。
  因为从胶上看，好象蛋白没有迁移到合适的位置，可能和泡胀不充分或不均匀有关。还有就是你的有关溶液的配置可能也有问题

• 小游abc (2014-6-26 17:25:10)

  由于楼主的图谱上有很多横条纹，这是第一向聚焦没聚好的主要表现．导致第一向聚焦没聚好的原因（我所知道的）有：１．温度，如果室温底于胶槽内的温度，在第一向时候会产生水汽，水汽凝结多了，影响胶槽电极的导电；２．如样品中含的核酸等杂志过多，核酸与蛋白质相互作用，造成蛋白质聚合，也会影响正常聚焦；３．盐浓度过高；４．胶槽内的ＤＴＴ终浓度偏高，由于它带电，也会造成影响；５．上样体积没有严格控制好，（加多了）在盖胶槽盒时造成胶槽内的液体外溢，影响胶槽盒电极与金属板之间的导电，最终影响聚焦．　
  至于解决的办法就是尽量避免上述情况的出现，比方说：控制好温度，开空调调节好室温；严格控制上样的总体积等等．　　　
  本人所知有限，请各位指教！

• 小游abc (2014-6-26 17:25:29)

  补充一下：上样时蛋白质样品中盐离子浓度不应该超过10mmol/L，可以使用层析，透析或ＴＣＡ／丙酮沉淀法脱区离子，或非离子型去垢剂浓度至少８倍于ＳＤＳ的浓度；有时候，聚焦时间不够也导致蛋白质点没有完全到达等电点位置