查看完整版本请点击这里:
【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT
【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT
各位,我做了几次SDS-PAGE和WESTERN BLOT,有几个问题总是出现,帮我看看是怎么回事吧!谢谢各位了!
1.用的是5%浓缩胶,12%分离胶,浓缩胶高度约齿下0.5厘米,分离胶高度约6.5厘米。浓缩胶电压40V,分离胶电压80V,浓缩胶30分钟就跑完了,分离胶2小时就跑完了。这个速度是不是太快了?
2.我用的是北京六一厂生产的电泳槽,不需要用琼脂糖封胶,但每次取下封边条后凝胶底部两玻板之间总有气泡,很难排干净。怎么办呢?
3.每次考染后都发现样品跑歪了,尤其是MARKER,歪到别的泳道上去了。怎么回事呀?
4.今天我封闭时不小心将膜的蛋白面朝下振荡了1小时,后来想起来了才将面翻过来。这对实验有没有影响啊?为什么一定要膜的蛋白面朝上呢?
查看完整版本请点击这里:
【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT
【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT
最新回复
tangxin_80 (2014-6-27 11:02:05)
1.速度不应该算太快,我们跑浓缩胶时用的是90v的电压,而分离胶是120v的电压一样很好。
2关于六一厂的电泳槽排气泡问题,我有个绝招,就是在到电泳buffer的时候,先倒外槽的液体,并且将槽子倾斜着倒,这样随着液面的上升,气泡逐渐就被赶出来了,我每次用的时候效果都不错的,可试试看。
3上样的时候应该保证各个lane的样品量一致,有人主张将MARKER也补齐同样的体积后上样,我个人觉得无所谓,可以上到边上或在两个样品量相同的LANE中间就可以了。
4只要膜不是贴的很紧,面朝下振荡应该对试验结果没什么影响,面朝上是为了保证与封闭液的充分接触。
蒲公英 (2014-6-27 11:02:33)
你的胶和缓冲液的配方可不可以告诉一下?怎么跑的那么快的啊?
我的是恒流的,20mA,而每次电压都会升到140V,要跑三四个小时才跑完。我感觉我的胶或者缓冲液有问题啊
sunbent (2014-6-27 11:03:02)
QUOTE:
你说得上样量一样是指的上样体积吗? 样品老是跑歪与胶底下有气泡有没有关系呀?另外, 膜的蛋白面朝下的话,蛋白有没有可能在平皿表面磨掉了呀?(不好意思,这个问题是不是有点可笑?但我的确有点担心。)sunbent (2014-6-27 11:04:01)
QUOTE:
我是照分子克隆上配的试剂。5*电泳缓冲液300ml:tris 4.53g,甘氨酸 28.3g,10%SDS 15ml,配置成300ml,并调ph为8.3.
12% 分离胶15ml:水 4.9ml,30%acr-bis 6.0ml,1.5Mtris-cl(ph8.8) 3.8ml,10%SDS 0.15ml,10%ap 0.15ml,TEMED 0.006ML.
5%浓缩胶5ml:水 3.4ml,30%acr-bis 0.83ml,1.0MTris-cl(ph6.8) 0.63ml,10%SDS 0.05ML,10%AP 0.05ml,TEMED 0.005ml.
我用的是恒压。你的电泳槽是不是跟我的不一样?我的槽子较小,15ml分离胶可以倒2块胶。
duoduo (2014-6-27 11:04:28)
duoduo (2014-6-27 11:04:46)
QUOTE:
确保你的缓冲液pH值和离子强度都没问题,我一般情况是浓缩胶用10mA稳流(此时电压在35V左右),分离胶用75V稳压,好像也是4h左右。mimili_901 (2014-6-27 11:05:04)
1.不算快吧,我们用的是3%浓缩胶,12%分离胶,浓缩胶110V,30分钟。分离胶140V ,50分钟就跑完了,最后结果很满意。
sunbent (2014-6-27 11:05:26)
我用的是1.5mm的板。玻板真的可以泡一下酸吗?原来老式的玻板我是泡酸的,这种玻板上面粘了玻璃板,我不敢泡。但我的玻板上的确有水珠挂壁。
我作了两次western blot,用DAB染色,都没有结果。很沮丧。有几个问题想请教各位高手,帮帮我吧!
1.所有的装试剂的瓶子都要高压灭菌吗?
2.文献是用的ECL的显色方法,但此方法对我来说有困难。听人说一定要先用DAB染出一点条带再上ECL,是这样的吗?
蒲公英 (2014-6-27 11:05:45)
我用的槽子跟你的应该是一样的,15ml做两块胶,可我的分离胶用140V跑出来全糊了!晕啊。我的老是觉得慢!还是要比较久。
tangxin_80 (2014-6-27 11:06:09)
上样量一样就是指的上样体积,但蛋白浓度此前应该调整为一致的,这样体积和浓度全一致,跑出的条带才能够保持一致。
样品老是跑歪与胶底下有气泡应该是有关系的。
膜的蛋白面朝下的话,蛋白一般不会在平皿表面磨掉,如果不放心最好翻过来蛋白面向上放置,当然最好是这样放的啦。: -)
蒲公英 (2014-6-27 11:06:26)
开始把气泡全赶掉了,但是 跑的过程中还是会有气泡,怎么办?
windy+++ (2014-6-27 11:06:46)
蒲公英 (2014-6-27 11:07:50)
你的电泳跑的好象有些快!“浓缩胶高度约齿下0.5厘米,分离胶高度约6.5厘米”浓缩胶的距离是不是小了点,这样可能在你拔梳子时候使浓缩胶与分离胶之间松动,试试1CM 吧!
【求助】请教SDS-PAGE和WESTERN BLOT