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【求助】bl21star中pET28a上与穿膜肽的融合表达问题!
小弟近来利用改造过的pET28a在bl21star中表达一个与穿膜肽融合表达的蛋白,本来与穿膜肽融合表达的蛋白的位置上原来是EGFP,而且原来的表达也没有什么问题,换成我的蛋白后就死活都不表达,换了一些条件也无济于事,敬请各位有经验的大侠不吝赐教!甚谢甚谢!【求助】bl21star中pET28a上与穿膜肽的融合表达问题!
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最新回复
831226 (2014-6-27 17:17:43)
顺便问一句,测序结果是否正确?
owanaka (2014-6-27 17:18:45)
测序结果没有问题!现在重新制备了bl21star感受态,重新转化,仍旧没见表达!仍在重复中。。。在考虑换用其它的宿主菌试试!
am10 (2014-6-27 17:19:07)
我现在想做一些关于穿膜肽方面的工作,你那里有这方面的资料吗》
可否共享一下~!!!
急切盼望中………………
am10 (2014-6-27 17:19:59)
还有构建的方向有没有验证!
owanaka (2014-6-27 17:20:21)
owanaka (2014-6-27 17:20:37)
一个完整蛋白碱基序列大小为1083bp,另外一个是其中的一部分碱基序列大小为183bp;构建的方向应该没有问题,是把原来表达过EGFP的载体去掉了EGFP换成了我的蛋白,现在大蛋白已经挑了10个克隆仍然不见表达,小一些的蛋白虽然有表达,但是预计大小应该为10.8KD,但是表达出来的蛋白却在14.4KD以上,准备进一步做Western验证,郁闷中...
大侠有何见解?请不吝赐教!
am10 (2014-6-27 17:21:12)
从你的表达情况看,你的载体没有问题,基因也没什么问题,宿主菌也没什么问题,表达的蛋白大小也并非是极限值,pET28a在不加诱导剂的条件下也可以表达,可以试试,再就是继续摸摸条件吧,低温、低IPTG.
我想问问,你的穿膜肽是合成的还是以其他方式得到的,还有就是能不能给我推荐一些关于穿膜肽的文献,毕竟,你是过来人了。
owanaka (2014-6-27 17:21:45)
不知道你想要哪方面的资料?现在网络这么方便,几乎一切都是透明的!我的穿膜肽是自己合成的!
am10 (2014-6-27 17:22:06)
那对于利用穿摸肽进行基因治疗你有什么高见>?
能不能留个比较方便的联系方式,常常联系?
好象你不常上网!
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