查看完整版本请点击这里：
【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？
大家好：【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？
我初次做试验就碰到一个难题：蛋白分子量只有7.5KD大。
做了十多次都没有成功，是哪个地方出了问题？？？
做的好累了，谢谢好心的XDJM
下面是我的试验步骤：：
Western blotting 的方法步骤
第一天：
脑组织蛋白的抽取：
⑴ 取小鼠海马、文状体、前皮质组织 ～200mg加1ml全细胞裂解液（组织裂解液（全细胞蛋白提取）：1：Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6：PMSF 1 mmoL/L 7：Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml），手动冰上快速匀浆。
⑵ 14000rpm离心40min
⑶ 上清即为抽取的蛋白，吸出分装，进行定量。（-20℃保存）
⑷ 将所有蛋白样品调至等浓度
电泳
制备聚丙烯酰胺凝胶：
1、 注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2、 SDS-PAGE 胶的配制
15%
30％丙烯酰胺 (ml) 4.0
4 X resolving (ml) 2
ddH2O (ml) 3.87 2
10%AP (μl) 40~~~~~~~~~~~~~~80
3、 混匀后小心将分离胶注入准备好的玻璃板中，到达第一条横线。
4、 封胶
5、 待胶凝后将封胶液倒掉，如用已醇封胶
6、 配制5％浓缩胶：插入梳子，室温下放置1小时左右。
5％浓缩胶
30％丙烯酰胺 (ml) 0.35
4 X stacking (ml) 0.75
ddH2O (ml) 1.97
10%AP (μl) 20~~~~~30
7、 灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
8、 加样
1）、小心移去梳子，将凝胶电泳板放入电泳槽，用夹子夹紧，然后在上下电泳槽中分别加入电泳缓冲液（running buffer）并使上槽缓冲液浸没胶面。
2）、上样前将胶板下的气泡赶走。
3）、电泳：预电泳： 将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。接通电源，电压120－130V，当染料的前缘接近凝胶的底端2cm，断开电源
转膜
1、电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：剪一块与胶大小一致的Hybond－P 膜，在甲醇中泡10 秒钟，再在转移buffer(transfer buffer)中浸泡10分钟，同时切下的胶也在转移buffer(transfer buffer)中浸泡一会儿然后按黑多孔板－>吸水隔层－》滤纸－》胶－＞膜－>吸水隔层－>白多孔板顺序将膜和胶叠好,排尽空气,放入槽中加入冰盒,倒入转移buffer(transfer buffer)。转膜时在冰块中进行。
2、36V恒压转膜2.5小时左右。
4、膜用塑料盒装好，加入封闭液（5％脱脂奶粉＋0.1％Tween20【Washing buffer】）封好盒子。室温摇床孵育30min。
5、倒掉封闭液，加入一抗（4℃过夜。（一抗用封闭液稀释）
第二天
1、 将膜用Washing buffer洗20分钟X 3。（用培养皿）
2、 将膜放入塑料盒中，加入HRP标记的－goat-anti-rabbit二抗,封好盒子。室温摇床孵育1小时。
3、 Washing buffer洗20分钟X 3。（用培养皿）
4、 PBS洗几次（用培养皿）
5、 在一保鲜膜上以1：1配制ECL，均匀滴加于膜上，作用5min，甩干膜，置于另一保鲜膜上包好显影（避光进行）。
谢谢！！
非常感谢！！
查看完整版本请点击这里：
【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？
【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？
最新回复
49888 (2014-6-28 17:02:06)
PINK (2014-6-28 17:02:33)
建议你的PVDF膜在甲醇中多浸泡一会,这样可以提高小分子量蛋白与膜结合的能力.
你有没有在转膜前对目的蛋白进行SDS-PAGE后染色实验,观察过蛋白是否很好的展现在胶上?这么小的蛋白在SDS上的分辨能力很不足.
另外转膜后的胶你也可以染色后观察蛋白是否转移走了.
49888 (2014-6-28 17:02:55)
我现在觉得有是否是一下问题：请高手指点。谢谢
1、匀浆时没加Na3VO4，但我加了NaF，防止蛋白磷酸化，只加这一种有用吗？
2、匀浆时只加了蛋白酶抑制剂，不知道是否含有PMSF ，是否对蛋白是否有影响？
3、我加样的量是30ul，是否还少了？没有进行蛋白定量，～200mg加匀浆液1ml，后蛋白变性时加1/3的5X上样缓冲液。
4、电泳时时间过长，因为没有含有7.5KD大小的蛋白Marker，只有最小分子量20KD的蛋白Marker，所以在溴酚兰跑到离底边5－6cm时不知道7.5KD的目的蛋白是否已经跑掉了？
5、转膜时条件还是不知道：36v2－4h（湿转）是否合适？我觉得这步是关键。
6、显影时一点都没有，光板，什么都没有，非特异性的条带都没有，是否能说明二抗有问题？我最多时加到1：400。
49888 (2014-6-28 17:03:16)
49888 (2014-6-28 17:03:42)
49888 (2014-6-28 17:04:37)
半干转膜1mA/cm2，90min相当于湿转的条件是多少？
谢谢
mickeylin (2014-6-28 17:04:54)
小分子电泳与一般大分子电泳使用的分离技术不一样,我用的是三层胶分离,由分离胶,间隙胶 和浓缩胶组成. 王旭,何冰芳 Tricine-SDS-PAGE 电泳分析小分子多肽[J] 南京:南京工业大学学报,2003,3
49888 (2014-6-28 17:05:12)
谢谢
但是它只有电泳方面的，没有电泳后面的过程，请问这么小的蛋白湿转的条件一般是多少？
谢谢
做的好苦呀，又没做出来
yjf1026 (2014-6-28 17:07:01)
1.你的转膜条件不对,36v2.5小时,你的蛋白早就转过了.建议10v 20min试下
2.甲醇泡膜时间加长为2-3min
肯定能成功.
dragonkilly (2014-6-28 17:07:23)
我丽春红S染色了，但胶和膜都没看到目的蛋白条带
我现在觉得有是否是一下问题：请高手指点。谢谢
1、匀浆时没加Na3VO4，但我加了NaF，防止蛋白磷酸化，只加这一种有用吗？
2、匀浆时只加了蛋白酶抑制剂，不知道是否含有PMSF ，是否对蛋白是否有影响？
3、我加样的量是30ul，是否还少了？没有进行蛋白定量，～200mg加匀浆液1ml，后蛋白变性时加1/3的5X上样缓冲液。
4、电泳时时间过长，因为没有含有7.5KD大小的蛋白Marker，只有最小分子量20KD的蛋白Marker，所以在溴酚兰跑到离底边5－6cm时不知道7.5KD的目的蛋白是否已经跑掉了？
5、转膜时条件还是不知道：36v2－4h（湿转）是否合适？我觉得这步是关键。
6、显影时一点都没有，光板，什么都没有，非特异性的条带都没有，是否能说明二抗有问题？我最多时加到1：400。
......
===============================================================================================================
现在有14KDa大小的MARKER的,我觉得有一点,你可以染半快,转半块,如果你的蛋白量很少的,那就用银染把,不过一般考马斯亮兰够了,这样你就知道你的蛋白跑出去了没,还有现在有可视MARKER,这样你可以大概在跑胶的时候就知道14左右的蛋白在哪里,
还有你应该把你转膜完的胶去染色,这样就可以知道是不是你没有转过去,还在胶上不,至于转过了没,你可以查查膜的参数,它可以转的最小的蛋白是多少,如果小于你的蛋白,不用担心转过头了,
还有就是用检测你的一抗和二抗了,一是否失效,二浓度是否合适,直接二抗加显色剂就可以看看是不是二抗的问题了,
我们以前用的也是PVDF膜,太烦了,还不如NC膜,方便,怎么做都出来
个人意见,仅供参考./color]
49888 (2014-6-28 17:08:18)
10v 20min??
这么小呀
我是湿转的呀
我试试看看
谢谢
DONT (2014-6-28 17:09:22)
能不能给我申请加一分啊,我做的蛋白只有3KD,在电泳时分阴极缓冲液和阳极缓冲液,不知道你注意没有,还有其阴极缓冲液和阳极缓冲液以及胶缓冲液的PH值都有限定的,最好是周围有人指导你做,这个挺难的.
我在转膜时用的是湿转,没有什么特别的.由于分子比较小,应比普通的转膜时间短一点.具体要慢点试,是比较难.
DONT (2014-6-28 17:11:26)
还有我不知道你怎样做的,我做一次大概需要2-3天左右,而你好象一天不到就做了一次,是不是有点快了,做胶要耐心一点,配液调PH值也需要一定时间的
【求助】7.5KD蛋白Western blot 怎么办？