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【求助】western转膜中的疑问
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本人现在努力的在转60kd大小的蛋白,转膜时间为2h,恒流250mA,每次预染的marker都转到了PVDF膜上,但是转膜后的胶上总是有很浓的蛋白,同时膜上没有特异性 的条带出现,很是郁闷.请高手指点!
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-6-30 15:51 作者: yyaxw84 来源: 分析测试百科网
最新回复
nut6694 (2014-6-30 15:54:02)
60 KD 的蛋白并不是很难转。你提供的条件有点少,我胡乱说说看。
我个人转过膜之后不测定胶上的蛋白,但是我的条件是20v 60min恒压转膜。和园子里的很多人的用法不同,但是做的也是不错的。
你的原因分析
首先保证你的蛋白提取没有问题,每个步骤都要快,不要耽误时间。
转膜根据分子量大小调整时间长短,我用的是BIO-RAD的半干转膜仪,20v,60min对于60KD的蛋白完全够用。你的如果感觉转膜不充分,在延长时间或是提高电流,摸索合适的条件。
另外,一抗的孵育是最重要的步骤,这一步是能否成功的绝对关键。调整时间,浓度,甚至公司有时又都是必须的,具体问题具体分析。
一家之言,仅供参考,祝你好运!
WB是一个很多步骤地试验,细节很多,多学习园子里的高手,多自己揣摩,相信你会成功。
2541 (2014-6-30 15:54:37)
2 hours is too long.
987789 (2014-6-30 15:55:41)
那么请教150kd的恒压半干转条件?不胜感激
yyaxw84 (2014-6-30 15:56:04)
感谢大家的帮助,但是我认为我的转膜时间不是过长,因为我的胶上的蛋白还有很多没有转干净。我的上样量是60ug,同样的上样量我在别的试验室也作了一次,他们的仪器和我们的一样的,都是bio-rad的,他们的转膜条件是250mA转2小时,转完的膜很干净,是不是我们的电泳转膜装置有问题呀, 我们可是新买的呀!!
am10 (2014-6-30 15:56:47)
western-blot的差异可真大啊
我们也是60kd左右的蛋白
100V转60min就足够全部转到膜上了啊
不过跟电流也有关系
如果电流小于0.2A的话就要多转5-10min
greenbee (2014-6-30 16:02:31)
200V for 1 hour is enough to transfer to the membrane. Is your transfer buffer OK? You need to use freshly prepared transfer buffer
gogo (2014-6-30 16:03:30)
我在转127kd的蛋白,转移后的胶染色没有条带,但膜用立春红染色却染不出来,请教。最近一次转膜稳压100v,但是电流一直在升,是为什么呀?急!
wood533 (2014-6-30 16:07:22)
is2011 (2014-6-30 16:08:15)
个人建议:
我一般使用100-110mA的稳流,在低温4度转膜两个小时,都能成功的。
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