【求助】亲和层析时目标蛋白先流出

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-6-30 16:50 作者: abc816 来源: 分析测试百科网

我正在做镍柱亲和层析．目前遇到这样一个问题：
我表达的蛋白是包涵体，经过８Ｍ尿素溶解，上样．可是在用３０毫摩的嘧唑（ＰＨ７.４）洗涤时，目标蛋白可以被洗下来一部分（穿透峰中没有检测到目标蛋白，表明柱子没有被饱和），奇怪的是这部分的峰是很平的，即：先比基线有所抬升，然后一直持续很久，才下降（始终峰值不是很高）．当用５０３０毫摩的嘧唑（ＰＨ７.４）洗涤时，目标蛋白和杂质蛋白被一起洗下来．我已经做了几次了，都是这样．其中我还在洗涤和洗脱缓冲液中添加了１０％的甘油，效果没有改善．请大家指教

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【求助】亲和层析时目标蛋白先流出

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最新回复

abc816 (2014-6-30 16:51:15)

不好意思，打错了，其中的5030 应该是50 mM.
qhyu (2014-6-30 16:51:33)

平衡buffer的pH是多少的？一般平衡buffer的pH比洗脱的高。
可以试试把洗脱缓冲液的pH提高一点看看效果怎样
abc816 (2014-6-30 16:51:53)

我的平衡buffer的pH是7.4。以前做过8.0柱平衡，然后7.4洗脱。但是效果还是那样。严重郁闷中。
qhyu (2014-6-30 16:52:14)

试试把洗脱缓冲液的pH提高看看效果
abc816 (2014-6-30 16:52:41)

请问，从理论上改变pH对亲和层析有何影响？为什么要替PH?请指教
zhenxin (2014-6-30 16:53:11)

咪唑本身有紫外吸收,可以再前面加10.20mM咪唑洗杂质.
IAM007 (2014-6-30 16:53:35)

我在平衡缓冲液中已经加入了15mM的咪唑。
mimili_901 (2014-6-30 16:53:57)

目的蛋白中，His-tag中的咪唑基团的电离度与pH值相关，提高wash buffer的pH值有利于目的蛋白与镍的螯合，从而使目的蛋白与柱结合率提高。我也曾经用过pH约7.4的wash buffer洗脱杂蛋白，出现了目的蛋白与杂蛋白同时流出的现象，后来提高pH到8.0，效果明显好转。同时在平衡液（我使用的也是pH8.0）中加入低浓度的咪唑也可以使杂蛋白的结合率降低，当然同时对目的蛋白也稍有所下降，但不至于影响与柱的结合（建议在10-20mM以内）。对于洗脱目的蛋白时，可以将pH有所下降，我当时使用的elution buffer（300mM）的pH为7.4。这样目的蛋白的洗脱速度比较快，相当于适当的浓缩了目的蛋白。我记得当时我在洗脱目的蛋白时加大流速后，目的蛋白洗脱峰很漂亮，整个峰的时间大概两三分钟（当然我是小柱10ml），体积大概在10ml左右。以上纯属本人的初见，但望高手指正。