【求助】小分子蛋白tricine－SDS 电泳只跑到分离胶的一半...

最新回复

• wu11998866 (2014-6-30 18:13:23)

  
  如图：

  
  94497554.snap.jpg

• wu11998866 (2014-6-30 18:13:40)

  有站友遇到类似的问题：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2792702_1.html')
  可能的情况有：1.浓缩胶太短；2.样品浓度过太大；3.电泳的缓冲液有问题，要用新的；4.进入分离胶后的电压是否小了。5.提取蛋白时，离心速度不够。有颗粒物。
  多摸素，好运！！！
  说明：1，浓缩胶有1cm，2，从图上看浓度好像不大啊，3，都是新的，4，有100v,5，样品比较清亮，况且marker也没有跑下来
  1、分离胶的配置是否有问题，尤其是分离胶缓冲液的pH值是否正确。
  2、内外电泳槽的电泳液是否有交通：因为tricine电泳的阴极缓冲液与阳极缓冲液成分及pH不同，如果相交通，也无法跑出漂亮的结果来。
  PH值准确，用的是伯乐的电泳槽，应该没有交联，
  跑了几次都是这样， 不知如何是好

• bamboo16 (2014-6-30 18:14:00)

  
  样品浓度过太大

• wu11998866 (2014-6-30 18:14:20)

  
  谢谢，我稀释一下试试看看

• qhyu (2014-6-30 18:14:45)

  请问你的问题解决了吗
  我的和你的问题差不多,小分子量的蛋白感觉都没了!
  也是伯乐的槽子和电泳仪
  解决了
  请告诉我改进的方法
  谢谢了

  
  25186502.jpg

• wu11998866 (2014-6-30 18:15:08)

  
  将样品倍比稀释8倍，16倍，32倍，只是下面一大坨变成了一条线，约15K处，感觉地下还是光板，请问该如何解决？

• wu11998866 (2014-6-30 18:22:44)

  QUOTE:

  原帖由 kent 于 2014-6-30 18:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  可能是你电泳缓冲液或者是胶的PH值不对

  按照文献，阳极缓冲液调到8.9，阴极的文献说不用调，约8.25左右，配胶还要调PH值吗？

• wu11998866 (2014-6-30 18:23:21)

  我的意思是配胶你用的tris buffer是否有问题,PH值准吗.

• wu11998866 (2014-6-30 18:27:14)

  是准的，不过既然这么说了我明天重配

• taoshengyijiu (2014-6-30 18:27:34)

  
  样品浓度过高!

• DONT (2014-6-30 18:27:57)

  谈一点个人看法，供参考。
  从你的条带来看，电极缓冲液应该是没有问题的。
  我想问题应该主要有两方面：
  1、从你的图来看，两个泳道均出现了很粗的条带，而且涨破了泳道，呈纺锤形，这说明你的蛋白浓度过大，可考虑稀释后上样，蛋白量20－50ug/孔。
  2、条带存在于浓缩胶中，没跑下来，marker也没跑下来（不知道你的分子量大小是多大的），应该是胶的浓度（浓缩胶和分离胶）过大，可适当降低浓度，就可以了。

• wu11998866 (2014-6-30 18:28:25)

  QUOTE:

  原帖由 DONT 于 2014-6-30 18:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  谈一点个人看法，供参考。
  从你的条带来看，电极缓冲液应该是没有问题的。
  我想问题应该主要有两方面：
  1、从你的图来看，两个泳道均出现了很粗的条带，而且涨破了泳道，呈纺锤形，这说明你的蛋白浓度过大，可考虑稀释后上样，蛋白量20 ...

  
  跑的是组织的蛋白，目的蛋白7K，后来做的时候已经稀释到200倍了，条带已经很浅了，但是底下那条比较粗的条带仍然停留在15K处。我先换一下缓冲液试试看

• fox_79 (2014-6-30 18:28:46)

  
  你的sample buffer怎么不用CBB-G250作指示剂呢?我现在也正在跑小分子电泳， 我的目的蛋白才4K,跑出来的结果好象还可以.起码条带很清楚.另外,在电泳时,电流千万不要太大,我在电泳时,电压加到40V,电流就有36mA,所以我就在电泳过程中，稍微对电压进行了一些调整.很多小分子胶电泳都提示要恒压(70-100),但是如果是新的电泳缓冲液会导致电流很大,应该对电压进行调整。最好不要让电流超过30mA，尤其不要超过40mA。电泳的时间确实是要长很多，我通常都要180min以上。所以现在实验室的人都怕我跑小分子了，因为我要跑上，通常要一个半天以上。我的电泳系统还没有整理好，等我整理好以后，发给你。

• ritou1985 (2014-6-30 18:29:10)

  
  我也是用CBG-G250做示综剂，溴芬兰跑得太快，不适合用于TRICINE系统

• fox_79 (2014-6-30 18:29:46)

  
  以下是我现在做的小分子电泳所用的系统，仅供参考：
  30% Acrylamide-bisacrylamide mixture
  29.0g acrylamide
  1.0 g bisacrylamide
  Add water to final volume of 100ml .Store 4°C
  Anode Buffer (10x)
  121.14 g Tris-base
  400ml ddH2O
  HCl pH8.9
  Add water to final volume of 500ml .Store 4°C.
  Cathode Buffer for (10x)
  60.57 g Tris-base
  89.6g Tricine
  5.0 g SDS
  Add water to final volume of 500ml
  When solution is diluted to 1x, pH=8.25 .Store 4°C.
  Gel Buffer
  90.75 g Tris-base
  200ml ddH2O
  HCl pH8.45
  0.75 g SDS
  Add water to final volume of 250 mL.
  Sample Buffer (2x)
  0.5M Tris-HCl()pH6.8) 2.0ml
  50% glycerol 4.8ml
  10% SDS 1.0ml
  2-ME(mercaptoethanol) 0.2ml
  Coomassie Blue G-250 0.2mg
  Add water to final volume of 10 mL. Store 4°C.
  Stain Solution
  50ml acetic acid
  225ml methanol
  225ml ddH2O
  1.25g CBB R-250
  Destain Solution
  50ml acetic acid
  225ml methanol
  225ml ddH2O
  Separating gel(8vml,16%)
  30%acrylamide-bisacrylamide mixture(29∶1) 3.3ml
  gel buffer 2.0ml
  H2O 2.2ml
  urea 2.16g
  10% APS 100μl
  TEMED 5-10μl
  Stacking gel(3ml,4%)
  30%acrylamide-bisacrylamide mixture(29∶1) 0.42ml
  gel buffer 0.75ml
  H2O 1.9ml
  10% APS 50μl
  TEMED 3-5μl
  在电泳时，电流建议不要超过30mA，最多时间稍长一些。最好是恒压（70-100V），如果电流过大时，电压应稍做调整。记得我当时使用新的阴阳极缓冲液40V电压时，电流就高达36mA，我是降压维持在30mA以内。后面随电泳时间延长，电流下降后，稍微增加电压，200min内跑完。效果还是不错，我的目的蛋白4K，纯化后的样品。

• wu11998866 (2014-6-30 18:30:13)

  谢谢楼上的两位，我做的是恒流10mA－20mA，电压35V－120V之间，zhangqw1978 ，你用的胶不是6C和3C？我用你的方法试试看

• u234 (2014-6-30 18:30:44)

  你的tricine现在跑的如何，有改进吗？

• nn255 (2014-6-30 18:31:13)

  我昨天也第一次跑胶，不过，还碰上了，结果还不错。想再多做点，就可以准备转膜了。我说不上来为什么，听大家说的都很好