【求助】蛋白质表达最优条件的摸索

最新回复

• qqq111 (2014-7-05 16:41:06)

  
  以下是我们的做法，供你参考（已经成功表达多个基因）：
  1.挑单克隆放入离心管中37度摇过夜（5ml左右即可）
  ２.过夜菌液按１：１００稀释继续摇到对数中期（测ＯＤ值）
  ３.加ＩＰＴＧ诱导３－４小时
  ４.收集菌体，电泳．
  其中第一步用试管即可，以下的步骤建议你用锥形瓶或烧瓶，具体用多大的瓶原则上按照：所摇的液体不超过瓶体积的２０％，即１０００ＭＬ的烧瓶别超过２００ＭＬ．摇床转速一般在２００转／分以上最好．
  具体到条件的优化，最主要的是诱导时的温度（第３步），他关系到可溶性表达比例的高低，ＩＰＴＧ的浓度影响不是太大，因为你现在不表达，建议你用一个ＩＰＴＧ浓度（０.２－０.６都行）实验就行了，先确定到底表不表达，再考虑优化条件．
  　　当然，每个基因不同所需的表达条件也不同，最终需要你自己摸索．
  ＧＯＯＤ　ＬＵＣＫ！

• vera+ (2014-7-05 16:41:27)

  谢谢你！我诱导时用的是15ml左右的试管，50ul菌液加入5ml培养基啊

• tie8 (2014-7-05 16:41:47)

  
  摇菌时瓶的底面积大小是比较重要的，试管底的面积太小了，我建议你把量做大点，反正程序是一样的，做的量少也不省事，烧瓶也就几快钱，如果还没结果估计上游出问题的可能性比较大了，基因不表达的理由可是有若干条啊，只能仔细分析了，呵呵。

• 831226 (2014-7-05 16:42:07)

  
  我认为你可以自己试着摸索一下你蛋白的最优化条件，因为不同的蛋白的表达条件都是不一样的。下面说一下我的蛋白（表达菌BL21）的表达条件：
  1，将转化后的平板中挑单个菌落，放3ml培养液中37度摇过夜。
  2，按1：100取50ul加入到五支分别盛有5ml培养基的试管中，摇至OD值为600，然后分别加IPTG至终浓度分别为0.2，0.6，0.8，1.0，1.2，摇菌4小时，然后分别跑胶看表达量。
  3，然后按IPTG最优化条件，再分别按1：10，1：50，1：100，1：150，1：200，然后摇菌4小时，然后跑胶看表达量。
  4，按IPTG和取菌量最优化条件分别加IPTG分别摇1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，分别跑胶看表达量。
  经过这几个步骤你就能综合出，你蛋白表达的最优化条件，大概需要三四天的时间吧。

• vera+ (2014-7-05 16:42:36)

  
  3，然后按IPTG最优化条件，再分别按1：10，1：50，1：100，1：150，1：200，然后摇菌4小时，然后跑胶看表达量。
  艳过刘痕，逆－上面所说的比例是指什么？谢谢！

• 831226 (2014-7-05 16:42:54)

  比例就是摇菌前所加的菌量和培养液的比例

• vera+ (2014-7-05 16:43:12)

  
  我又做了一轮实验，结果SDS－PAGE的结果显示的蛋白并不是我需要的分子量，我的目的蛋白分子量在21kd左右，可是电泳得到的新条带分子量在120kd附近，难道是形成包涵体了吗？还可能是什么原因？请各位有经验的老师指点迷津。
  谢谢

• hold住 (2014-7-05 16:43:29)

  你的重组质粒的宿主菌是BL21吗？
  你可以重新提取质粒，看看菌里的质粒还在不在了，是不是在保存过程中质粒丢失了；提出的质粒可以送去测序，看看是不是你要的质粒，有没有突变；同时可以把提出的质粒重新转化一次，再做诱导表达。
  个人意见，仅供参考

• vera+ (2014-7-05 16:43:46)

  
  谢谢！我只是做下游的蛋白质表达和纯化以及单抗制备，上游的工作是另一个人做的

• hold住 (2014-7-05 16:44:04)

  
  你也怀疑菌有问题，总得先证明菌没有问题才能保证后面的工作有意义

• vera+ (2014-7-05 16:44:26)

  
  如果不是菌种的问题，还有哪些因素会导致没有目的蛋白表达呢？
  心急如焚！希望有经验的老师赐教！

• standbyme (2014-7-05 16:45:06)

  
  1诱导时的菌提浓度对他的表达量影响可能很大,,,,反正在我的实验中是这样的
  2.你可以看一下在诱导前后细菌的军体蛋白在电泳图上有无变化,,我觉得在这种图上可以大概判定基因是否转录,,也就是说估计一下是在转录还是翻译水平上出现了问题..或者是蛋白在翻译后是否被降解....
  还有设对照看加诱导剂后细菌的生长情况.等
  总之我觉得应该将各种现象观察仔细综合分析..应该是能发现一些迹象的

• standbyme (2014-7-05 16:45:31)

  
  还有,,你的氧含量明显太低,,,这也是一个对表达影响很大的因素哟..我在做一个lac启动子表达时只要容氧量低于70%,,,转束低于180 温度低于35.5就无表达
  呵呵 一点感受,,别见笑

• abc816 (2014-7-05 16:45:54)

  
  建议楼主给出更详细一点的信息，比如：载体名称，宿主菌。大家好帮你出谋划策！

• jkobn (2014-7-05 16:46:18)

  我认为你可以自己试着摸索一下你蛋白的最优化条件，因为不同的蛋白的表达条件都是不一样的。下面说一下我的蛋白（表达菌BL21）的表达条件：
  1，将转化后的平板中挑单个菌落，放3ml培养液中37度摇过夜。
  2，按1：100取50ul加入到五支分别盛有5ml培养基的试管中，摇至OD值为600，然后分别加IPTG至终浓度分别为0.2，0.6，0.8，1.0，1.2，摇菌4小时，然后分别跑胶看表达量。
  3，然后按IPTG最优化条件，再分别按1：10，1：50，1：100，1：150，1：200，然后摇菌4小时，然后跑胶看表达量。
  4，按IPTG和取菌量最优化条件分别加IPTG分别摇1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，分别跑胶看表达量。
  经过这几个步骤你就能综合出，你蛋白表达的最优化条件，大概需要三四天的时间吧。
  ......
  
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  说错了，应该是摇到OD600＝0.5

• vera+ (2014-7-05 16:46:36)

  
  不好意思，我想问一下。如果空载体的表达情况很好，可是融合蛋白就是不表达，会不会也跟菌有关呢

• PINK (2014-7-05 16:46:59)

  
  如果是那样，说明细菌没问题，可能是：
  1. 融合蛋白基因序列有问题，测序鉴定；
  2. 表达蛋白对载体细菌有毒性，可通过用加葡萄糖的LB来鉴定，具体方法就不写了，搜搜园子里一大堆关于表达蛋白毒性及解决方法的帖子；
  3. 换一下表达条件，摸个梯度，包括IPTG，表达时间等等。