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【求助】我的表达问题(路过的请进)
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我是用载体pHIL-S1在毕赤酵母GS115中进行表达的。在invitrogen的protocol上没有提到用G418来筛选,而只说了用AOX1引物做PCR和用MM/MD来筛选出Muts和Mut+。我也是按照上面做的,并且PCR也得到了2.2KB和我要的目的带,用MM/MD也筛选也出现了明显的差别(即:在MM/MD上长的不一样)。忘记说了,这个载体是分泌型的。
但是问题就出现在表达环节上。按照protocol上面的步骤,我分别在诱导6、12、24、30小时取样,并取上清做SDS-PAGE分析。按照道理说,应该只有一条带出现,但是却出现了两条带。其中的一条和目的带大小差不多,而另一条则要大很多。请高人为我解释一下吧。
谢谢了。
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最新回复
jrwyyplt (2014-7-05 17:22:00)
lixi559 (2014-7-05 17:22:18)
另一条大很多的可能是蛋白的二聚体或者多聚体吧
greenbee (2014-7-05 17:22:35)
western吧,是否为目的蛋白就清楚了。再考虑翻译后修饰的问题。
PCR (2014-7-05 17:22:55)
谢谢各位了
我也想过用western日,但是,由于我表达的这个基因目前没有人做过,也就找不到合适的抗体来进行western。同时,这个载体没有his等之类的标签。
“另一条大很多的可能是蛋白的二聚体或者多聚体吧 ”我觉得不是很有可能,用SDS-PAGE进行电泳的话,不是能把蛋白的亚基能分开的吗?怎么能是二聚体或者多聚体呢?
我目前也只是通过其大小来判断。还有其他的什么方法吗?
PCR (2014-7-05 17:23:17)
one (2014-7-05 17:23:31)
做对照吧,多设几个对照,设一个未诱导的,设一个宿主诱导的,再设一个含载体的诱导的。看看那条大带是由谁引起的。
PCR (2014-7-05 17:23:57)
谢谢!
最近有个怪问题,以前表达的很好,现在却感觉表达量很小,有时候用上清几乎就看不见。有什么办法解决吗?
另外,SDS-PAGE的胶最近老是很难凝,这究竟是怎么回事啊?能否给予我帮助。谢谢!
DDD (2014-7-05 17:24:21)
QUOTE:
表达量降低可能的原因是菌种退化,以前表达量高的时候按时保存菌种,并定期转接,有必要的话重新转化。
PAGE胶难以凝结,问题一般处在过硫酸铵和TMED上面,这两种试剂作为催化剂未丙稀酰胺聚合提供自由基,用量不足或放置过久引起的变质都会减弱聚合反应,试试重新配制过硫酸铵。
bongte (2014-7-05 17:24:44)
两条带,有一条是不是菌体本身的啊!
一般阴性对照我设两个:空载体加IPTG同等条件诱导
质粒(含有目的片断)转菌后不加IPTG诱导
有些细菌它本身就有蛋白表达!
PCR (2014-7-05 17:25:08)
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我的菌株是刚转化的,以前表达好的是以前转化的。
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