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【求助】原核表达纯化前的菌液处理问题
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请教各位, 我表达的蛋白带his标签,用的PET32a共95KD,该过镍柱了,但是我现在不知道我表达的蛋白是可溶性的还是包涵体.
1. 能不能直接就按分子克隆上的步骤处理菌液,即: 溶菌酶处理后3000g离心30min,上清过柱? 如果是包涵体的话, 不加尿素溶解,能挂到柱子上么?
2. 还有个问题, 如果不加DNase去除DNA,对纯化有影响么? 超声可以裂解DNA么? 请教各位有经验的战友了,过柱前都怎样破碎细菌才能够比较完全呢? 例如100ml菌液沉淀重悬于5ml PBS中,要多大频率超多久呢? 还需要加溶菌酶处理不?
谢谢各位了!
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最新回复
avi317 (2014-7-05 21:28:35)
1,仅仅加融菌酶是很难破菌的
2,包含体没有裂解不能直接挂柱,有用柱上复性的方法,但并不实用
3,你可以用这个反复超声破菌,上清过柱纯化
湿菌体和缓冲液的重量体积比一般未1:6-1:10
确定合适的超声剂量是关键,一般来说,超声剂量很难有个确定的标准,随菌体冻存情况、重组蛋白表达量、菌株都有关系。一般用大肠杆菌破菌时,适宜采用的参数是400-600 w的功率,超1s,停1s,循环次数500-800次,如果超、停的时间为5s,次数做对应的减少。一般需要通过镜检来观察是否破菌完全,保证冰浴。 超声后25000g离心30分钟,然后继续纯化实验。
4,核酸较多的时候会引起超声后溶液粘稠,可以加入核酸酶消化。不加的话,蛋白粗提溶液稀释后也可以上柱,但流速和浓度适当降低。
zhenxin (2014-7-05 21:29:38)
我最开做始纯化时是反复冻融裂解细菌,DNA确实会引起溶液粘稠影响过柱。如果不想加DNA酶(只要一点就够了),就硫酸铵盐析一次。不过超声后还有DNA影响纯化的还没遇到。
chengjie79 (2014-7-05 21:30:13)
windboy (2014-7-05 21:30:37)
谢谢楼上几位战友的解答!
我昨天试着超声后离心12000r15min,发现沉淀是黑色的,是不是证明我的蛋白是包含体呢?我将沉淀上清跑电泳,发现沉淀跑出来好像是大部分的全菌蛋白,上清的泳道条带很淡都看不太清楚,我估计是菌液太稀了。
windboy (2014-7-05 21:31:30)
windboy (2014-7-05 21:32:21)
fei1226com (2014-7-05 21:32:48)
至于确定蛋白表达方式,可以在取样的时候,取等量体积,然后高速离心,将上清和沉淀都跑电泳,比较目标条带,才可以确定你的蛋白是包含体还是分泌型的。
一般纯化需要的只是上清中有活性的可溶蛋白,所以沉淀部分和包含体都通过离心去除。之所以高速离心,是充分保证得到的上清中没有不溶的沉淀。一般是需要20000g以上离心才可以。相反,如果只是需要包含体的话,比较低的转速8000g就可以了。
xevin (2014-7-05 21:33:23)
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过柱的时侯要用尿素或盐酸胍溶解的。
avi317 (2014-7-05 21:34:24)
我做的时候,过柱之前先用含有6M尿素的1倍结合缓冲液冰上溶解包涵体,16000g离心半个小时,再过0.45虑膜。
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