【求助】 大神们帮我分析下我的PCR怎么了？

最新回复

• ladyhuahua (2014-11-28 22:37:03)

  
  根据的我自己的PCR经验，这里可能有三种原因：
  一、可能你的模板内部有很多的重复序列
  二、你的模板的gc含量较高，你在用PCR技术时退火的温度较低，导致杂带现象很严重
  三、可能你得到的模板DNA纯度不是太好，里面含有大量的蛋白质杂质

• zbboom (2014-11-28 22:37:22)

  
  从结果看，可能是1）非特异扩增；2）模板降解
  我想 会不会是你使用的酶使用次数多了或是保存不当等原因，使得酶的活性降低引起非特异扩增？
  还有你的模板是什么？如果是一步法 RNA模板确实容易降解。
  

• ilovegaga (2014-11-28 22:37:38)

  后面三个孔的退火温度可以升高一些
  

• dotaaa (2014-11-28 22:38:09)

  QUOTE:

  原帖由 ladyhuahua 于 2014-11-28 22:37 发表
  
  根据的我自己的PCR经验，这里可能有三种原因：
  一、可能你的模板内部有很多的重复序列
  二、你的模板的gc含量较高，你在用PCR技术时退火的温度较低，导致杂带现象很严重
  三、可能你得到的模板DNA纯度不是太好，里面含有大量的 ...

  可是原来条件和现在是一样的，模板也是一样的，开始是能扩出来的啊

• dotaaa (2014-11-28 22:38:38)

  QUOTE:

  原帖由 zbboom 于 2014-11-28 22:37 发表
  
  从结果看，可能是1）非特异扩增；2）模板降解
  我想 会不会是你使用的酶使用次数多了或是保存不当等原因，使得酶的活性降低引起非特异扩增？
  还有你的模板是什么？如果是一步法 RNA模板确实容易降解。
  ...

  我使用的是人血DNA的模板，之前所有的条件都是一样的，可以扩出来，忽然就扩不出来了。。。酶也是新换没多久

• dotaaa (2014-11-28 22:38:55)

  QUOTE:

  原帖由 ilovegaga 于 2014-11-28 22:37 发表
  后面三个孔的退火温度可以升高一些
  

  原来的所有条件和现在都是一样的，可是原来是可以扩出来的，现在忽然就扩不出来了不知道是什么原因啊。。。

• 子衿青青 (2014-11-28 22:39:30)

  QUOTE:

  原帖由 dotaaa 于 2014-11-28 22:38 发表
  
  原来的所有条件和现在都是一样的，可是原来是可以扩出来的，现在忽然就扩不出来了不知道是什么原因啊。。。

  是不是你的模板质量不一致啊？
  再者，你再摸一下引物的退火温度

• jingling845 (2014-11-28 22:39:57)

  
  加入适量DMSO或者Betaine试试看呢。。。

• dotaaa (2014-11-28 22:40:40)

  QUOTE:

  原帖由 子衿青青 于 2014-11-28 22:39 发表
  
  是不是你的模板质量不一致啊？
  再者，你再摸一下引物的退火温度

  模板应该是一致的，之前就是用这个做的啊，做出来了，那我再摸下退火温度试试吧，谢啦~

• chengjie79 (2014-11-28 22:41:14)

  还有种可能是你的  水污染了，建议试剂和离心管枪头等换掉再试。
  另外拖带的时候，我们有时候降低模版DNA量时候可有可能好转；
  再不行就只能换聚合酶了。
  

• vcve (2014-11-28 22:41:42)

  
  或者换换扩增酶~

• bangqi_k (2014-11-28 22:42:04)

  
  那会不会你是用的模板时间长了降解了呢？

• dotaaa (2014-11-28 22:42:32)

  QUOTE:

  原帖由 bangqi_k 于 2014-11-28 22:42 发表
  
  那会不会你是用的模板时间长了降解了呢？

  理论上应该不会啊，因为这个都是在—20度保存的，而且本身已经很长时间了，开始用的 时候都没事的，谢啦

• dotaaa (2014-11-28 22:43:03)

  QUOTE:

  原帖由 vcve 于 2014-11-28 22:41 发表
  
  或者换换扩增酶~

  酶刚换过不久啊，谢啦

• HPLC使者 (2014-11-28 22:43:20)

  
  怎么样了？是否有进展，我也遇到同样问题，郁闷啊

• qqshepherd (2014-11-28 22:43:43)

  你的模板可能有问题

• dotaaa (2014-11-28 22:44:09)

  QUOTE:

  原帖由 qqshepherd 于 2014-11-28 22:43 发表
  你的模板可能有问题

  用其他模板试了下，还是一样

• dotaaa (2014-11-28 22:45:14)

  QUOTE:

  原帖由 HPLC使者 于 2014-11-28 22:43 发表
  
  怎么样了？是否有进展，我也遇到同样问题，郁闷啊

  木有进展啊，换了酶，换了水，换了buffer,Mg离子，就是没有进展，能扩增出条带，但是是那种涂抹带，不知道是怎么回事了。。。

• dotaaa (2014-11-28 22:45:58)

  加入适量DMSO或者Betaine试试看呢。。。
  
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  这个文章看了一下，如果其他的方法都不行，就想试一下加DMSO，他的意思是在buffer里面加入百分之五的DMSO就可以了吗？

• dotaaa (2014-11-28 22:46:21)

  QUOTE:

  原帖由 chengjie79 于 2014-11-28 22:41 发表
  还有种可能是你的  水污染了，建议试剂和离心管枪头等换掉再试。
  另外拖带的时候，我们有时候降低模版DNA量时候可有可能好转；
  再不行就只能换聚合酶了。
  ...

  换了水，换了酶都没有好转，下次降低模板量看看。。。要不就加DMSO了