【求助】荧光定量PCR扩增曲线太平缓

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-11-29 10:58 作者: yhz1973 来源: 分析测试百科网

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【求助】荧光定量PCR扩增曲线太平缓

大家好，我是刚开始做荧光定量pcr。做的事Taqman探针法荧光定量，现在还在摸条件中，用的是takara的预混酶。做了几次扩增曲线都很平缓。附图就是我做的结果，想向各位请教一下，该怎么改进。

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最新回复

toy (2014-11-29 10:59:03)

引物探针设计信息能给看下嘛？
yhz1973 (2014-11-29 10:59:49)

QUOTE:
原帖由 toy 于 2014-11-29 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
引物探针设计信息能给看下嘛？
多谢回复
引物TM值52.74,GC含量44.44%。探针TM61.9，GC含量60%
我做的是鸡传贫的。现在做了低浓度的，发现曲线还可以，就是低浓度的分不开。水里面也老是能跑出来。帮忙看看吧
yhz1973 (2014-11-29 11:00:24)

QUOTE:
原帖由 kent 于 2014-11-29 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

扩增效率不高，是不是模板GC含量较高，或者上下游引物Tm相差比较大。
多谢回复。模板GC含量都是44.44%，TM值也都一样，都是52.74.
现在的问题是低浓度分不开。
yhz1973 (2014-11-29 11:01:16)

好的，多谢啦。我试试。我之前做过用两步法，退火延伸在一起60°，但是感觉还是跑不开。我明天再试试降低延伸温度吧。
junhun (2014-11-29 11:01:34)

降解了，扩增效率不高
nn255 (2014-11-29 11:01:52)

应该先用SYBR预混业看看引物的扩增效果怎么样，SYBR曲线典型S型，那么俺估计就是探针的问题了。
探针法引物和探针的浓度及配比优化时很麻烦的。
yhz1973 (2014-11-29 11:02:08)

QUOTE:
原帖由 nn255 于 2014-11-29 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
应该先用SYBR预混业看看引物的扩增效果怎么样，SYBR曲线典型S型，那么俺估计就是探针的问题了。
探针法引物和探针的浓度及配比优化时很麻烦的。

谢谢，我已经摸好条件啦