【求助】隐约有暗带，是引物特异性不高还是退火温度...

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-1-13 17:21 作者: yyaxw84 来源: 分析测试百科网

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【求助】隐约有暗带，是引物特异性不高还是退火温度...

今天跑的pcr，同一个基因，设计了两对引物，marker后1~3是800bp长的片段，4~5是600bp才片段，最后一个是阳性对照。
1~3的引物退火温度是55℃左右，引物报告单上是57.3℃和53℃；
4~5用的引物退火温度是56.3℃和55.9℃，引物报告单是的退火温度是55.4℃和57.6℃。

PCR仪设定的退火温度是53℃，为什么在1~3泳道里，有两个暗带呢？4~5也有，
是引物特异性不好的原因，还是退火温度低、特异性差导致的呢？
请大家帮忙解答！

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最新回复

dragonkilly (2015-1-13 17:22:02)

杂带多引物特异性不好或者是退火温度低
eric930 (2015-1-13 17:22:20)

可以尝试下Takara的primer star，这个酶功能很强大，属于高保真酶，P出来效果可能会有改善
junjie05 (2015-1-13 17:22:38)

marker跑的都不清楚，胶都制的不太好，可以做个退火梯度从新跑一下看看~如果退火梯度不理想，那就是引物特异性问题了！
misswu61 (2015-1-13 17:22:57)

做个退火温度的梯度，如果提高温度差不多的话，就重新设计引物，引物特异性不好
whitesheep (2015-1-13 17:23:15)

做个梯度PCR试试吧
yyaxw84 (2015-1-13 17:23:41)

QUOTE:
原帖由 misswu61 于 2015-1-13 17:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

做个退火温度的梯度，如果提高温度差不多的话，就重新设计引物，引物特异性不好

今天下午刚跑了一个梯度，但效果还是不好，条带暗，而且有杂带。请问如何设计引物，或用什么软件分析能增加特异性呢？
qhyu (2015-1-13 17:23:59)

一般用PP5（ Primer Premier5.0）软件，你问问师兄师姐应该都有这个引物设计软件。
mingming0638 (2015-1-13 17:24:16)

可用降落PCR试试
gemei0115 (2015-1-13 17:24:41)

今天下午刚跑了一个梯度，但效果还是不好，条带暗，而且有杂带。请问如何设计引物，或用什么软件分析能增 ...

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平时都是直接看的，设计完直接在NCBI中BLAST一下就可以了，看看特异性，不行再换。不过PRIMER5.0是个不错的引物设计软件。可以学一下。