【求助】双酶切出来的片段比我的目的片段大

最新回复

• rxcc33 (2015-1-13 17:43:16)

  貌似720和750从电泳图上看也分不了那么清吧~

• pulala (2015-1-13 17:43:37)

  
  确定吗？30bp的差别可以准确看出来吗？

• join (2015-1-13 17:43:55)

  没事的，一般都会有误差，应该是正确的，直接拿去测序即可，或者菌液pcr，直接用你设计的原核表达的带酶切位点的引物p。

• koook5695 (2015-1-13 17:44:16)

  QUOTE:

  原帖由 join 于 2015-1-13 17:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  没事的，一般都会有误差，应该是正确的，直接拿去测序即可，或者菌液pcr，直接用你设计的原核表达的带酶切位点的引物p。

  测序不正确 只有30%多的一致性  我问过别人 有人怀疑说是连接上非特异性片段了

• koook5695 (2015-1-13 17:44:41)

  QUOTE:

  原帖由 koook5695 于 2015-1-13 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  测序不正确 只有30%多的一致性  我问过别人 有人怀疑说是连接上非特异性片段了

  那就是引物特异性的问题了   

• koook5695 (2015-1-13 17:45:01)

  pcr产物胶回收 可以直接测序的

• koook5695 (2015-1-13 17:45:17)

  QUOTE:

  原帖由 koook5695 于 2015-1-13 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  pcr产物胶回收 可以直接测序的

  引物特异性不好 怎么办  还能做出来么

• koook5695 (2015-1-13 17:45:40)

  QUOTE:

  原帖由 koook5695 于 2015-1-13 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  引物特异性不好 怎么办  还能做出来么

  1.条件优化   寻找最适Tm
  2.重新设计引物    一次设计3对    提高成功概率

• toy (2015-1-13 17:46:01)

  同意楼上，直接将你酶切的产物割胶回收做PCR也可以试试。这样就可以鉴定你是不是连接了非特异性片段，然后再将PCR产物拿去测序。

• uaubc (2015-1-13 17:46:28)

  
  这么差别是有可能发生的，这跟各个方面都有关系，电泳并不是说能反映片段的具体大小，只是在一个大概范围呢，而且你用的没切位点应该不是刚好在片段的两端吧，最好的办法就是拿去测序。

• daod (2015-1-13 17:46:48)

  测序吧，测出来的才知道什么！而且一般的测序只有800-900bp 的准确度，测序准不准要看它的峰图了。