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【求助】怎样消除引物二聚体？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-1-14 10:33    作者: jebel    来源: 分析测试百科网

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【求助】怎样消除引物二聚体？
我的引物是75bp的长引物，pcr的时候总是出现很亮的引物二聚体，比目的条带还亮。我试用过把引物煮沸5分钟迅速冷冻再加样的方法，发现没什么区别，还是很亮。是不是长引物就很难消除引物二聚体啊。求教～～～～
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最新回复

  • redbutterfly (2015-1-14 10:34:02)


    你PCR加样是在冰上加的吗？低温可以防止出现引物二聚体的，在PCR时等到机子运行了，升到95摄氏度的时候再把样品加到PCR仪里，那样也能降低引物二聚体的形成

  • jebel (2015-1-14 10:34:54)

    嗯，我是在冰上做的，而且引物我还煮沸过，都没什么效果，我的引物配对的部分都是一样的，只是5‘端加的50bp碱基不一样。我的irp1引物是P1:atggataacttgcgcttctcttctgcgccgacagcagattccattgatgcAATTAACCCTCACTAAAGGGCG     
    P2:gcaaaataccgcgagacgggcttccggcccggaaaataccgtatgttgcgTAATACGACTCACTATAGGGCTC   
    我的参数是：98度30s－[98度10s－58度30s－72度90s]×30－72度10min
    irp2引物是
    P1:tcaggaggaagaatgatttctggcgcaccatctcaggattcgctgttaccAATTAACCCTCACTAAAGGGCG
    P2:ttttctcgcgccgtgcggcaggctgatccagcgaaaccggaacgtaaaccTAATACGACTCACTATAGGGCTC
    参数：94度5min－[94度1min－60度1min－72度90s]×30－72度10min
    irp1能够P出来，但有很亮的引物二聚体，irp2就是不灵敏，有时P出来，有时P不出来，试过好几个Tm

  • redbutterfly (2015-1-14 10:35:16)

    你直接用2步法可以吗？95度--68度，退火和延伸一步完成？

  • ha111 (2015-1-14 10:35:53)


    可能是引物太容易配对了，不行就换对引物吧

  • jebel (2015-1-14 10:36:16)

    之前师姐做的时候已经换过了，这次的就是这个不给换，用这个引物的话就是有时候能做出来有时候不能做出来

  • jebel (2015-1-14 10:36:55)

    还没有做过2步法的，怕引物太长有影响。我用的是takala的高保真酶P的。就是有时有结果有时没有

  • birdfish (2015-1-14 10:37:14)


    你出错的原因还是在引物上，太长的引物是会出现这种情况的。为什么不设计短引物？引物在17-50bp范围都扩增的出来的。你这里这么长，难道是修复的点靠近3'端？这样的话也不要紧啊。你可以设计2对引物扩增100bp的大小带下来就好。

  • jebel (2015-1-14 10:38:07)

    因为我做的是同源重组，用的是加了同源臂的50bp引物，这样PCR后的产物就直接是我要的重组片段。我看了相关资料资料，你说的方法是之前做同源重组常用的，但很复杂，麻烦。我用的这方法是试剂盒提供的新方法，并有人做成功的。

  • 3648755 (2015-1-14 10:38:30)

    楼上说的挺全的，另外还可以考虑用热启动酶，如有更多问题，请联系我们，我们将为您提供更多更全面的技术支持。

    上海诺伦生物医药技术有限公司
    技术支持

  • jebel (2015-1-14 10:38:59)

    我用的宝生物的高保真酶就是热启动的。引物已换过了，老板不肯再换了，真难做～～

  • kswl870 (2015-1-14 10:39:35)

    消除引物二聚体：
    1、适当提高退火温度。
    2、降低引物用量。
    3、用热启动酶。

  • mingming0638 (2015-1-14 10:40:00)

    我也是，用一对引物，有时可以做出来，有时做不出来，后来你是如何解决这个问题的

  • jebel (2015-1-14 10:40:23)

    QUOTE:

    原帖由 mingming0638 于 2015-1-14 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我也是，用一对引物，有时可以做出来，有时做不出来，后来你是如何解决这个问题的
    后来我干脆一次做好几管，然后纯化P出来的。相当于是5选3那种的。这个产物我用的也不多，最后结果也做出来了

  • yueban-1147 (2015-1-14 10:40:55)


    你先用软件测试下引物是否形成二聚体，如果没事的话就看一下反应体系，一开始我做50ul的体系里加上下游引物各1ul，引物二聚体比较明显，然后我减少用量，加了0.8ul，就基本看不到二聚体了，你试试吧

  • pulala (2015-1-14 10:41:14)


    直接做胶回收不行吗？

  • jebel (2015-1-14 10:41:45)

    QUOTE:

    原帖由 pulala 于 2015-1-14 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    直接做胶回收不行吗？
    P都P不出来，胶回收量更少了啊，不过我已经做完了，呵呵

  • junhun (2015-1-14 10:41:59)


    做个退火梯度试下，温度增高，二聚体会减少，95度煮沸的方法我也试过，没看到显著差别，结果发现要把上下引物加一起再煮沸，打算再试下DMSO

  • zwsyrt (2015-1-14 10:42:21)

    请问楼主最后怎么解决了呢，我最近也为二聚体困扰，关键是有二聚体后目的基因很暗啊
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