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【求助】PCR实验求助
肿么感觉自己最近这么倒霉尼,做个实验咋这样不顺利尼?各位好心的朋友请帮帮我吧。【求助】PCR实验求助
这是我今天跑的电泳图,2000的Marker,图中24 33号pcr已经做过好多次了(33号目的片段比24号稍大一些),以前每次都挺成功的,今天想送个测序,测序公司说PCR产物要50ul。于是我就讲24 33各做了两管(每管25ul的反应体系),做完之后跑电泳验证一下,没想到就成了这个样纸,肿么回事呀,用的以前的PCR条件呀
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最新回复
爬呀爬 (2015-2-14 22:24:52)
加样的时候我是分开加的,即每管先一个个加了引物,再加酶、水、DNA,每次都换枪头,加样时每管必然都有些误差,但我只能保证减小到最小,我感觉每管分开加样可以保证酶、引物的量,避免了4管酶、水、引物加一起后再分装带来的不均匀
这次PCR既然是完全同样的条件(反应体系,加样手法、PCR条件),一个出了结果,另一个没出,那么酶、引物、水、PCR条件应该是没问题的吧
记得以前做PCR时总像师姐抱怨我们的枪太难用,加2ul的DNA总是打出来一部分又被吸回去一部分,现在想想应该是因为DNA本身有些粘稠的原因吧,但是现在有个奇怪的现象(我的DNA是5月份用煮沸法提的)现在加DNA一点都不费劲了,还以为自己手法熟练了,仔细想想应该是现在的DNA不那么粘稠了(还是5月份提的那批DNA),这是什么原因呢?有没有知道的朋友,这说明了什么,DNA 降解了还是怎么回事?
还有就是我们实验室的习惯是,加样之后先微离心,然后用漩涡振荡器震荡混匀,再微离心,最后把EP管放入PCR仪里。这个过程中一直让我很纠结的是震荡混匀这一步,这一步我怕把DNA 震断了,扩不出大片段,可是又担心不震荡混不匀,朋友们这一步你们是怎么理解的,可以指点一下吗?
现在感觉到当时为什么学生化那些基础课程了。。。
跪求各位朋友指点迷津
mod=8048 (2015-2-14 22:25:13)
mod=8048 (2015-2-14 22:26:16)
QUOTE:
PCR前不需要震荡混匀啊,加完试剂后用枪轻轻吹打均匀就可以,然后瞬离一下就可以进行PCR了,而且分子是可以扩散的,在那么小的体系里面,它自己都可以混匀了,个人拙见,仅供参考。yyaxw84 (2015-2-14 22:26:44)
谢谢楼上朋友的热心帮助!
因为面临着毕业,所以这几天稍有些着急,希望能快点结束实验,可真是应了那句话呀“欲速则不达”,不信不行!
其实两周前我就把PCR条件摸索好了,那时每次都要经过剧烈震荡这一步,结果都挺好的。
现在想送个测序,再做反而效果不好了,有时甚至不出,有朋友说是因为手法不稳定,可这个“手法不稳定”确实不好具体说怎样改善,有时候小心翼翼的做实验结果反而没有漫不经心做的好。。。无法解释
明天继续,经验慢慢积累吧
quiqui008 (2015-2-14 22:27:05)
不必一个个加,但要保证体系均匀。仔细些做就可以了
seagate (2015-2-14 22:28:12)
PCR反应液可以一起加入混匀后分装,分装后再加入模板就不会存在模板DNA震荡断裂的问题,而且大体积配试剂能减少误差。
lagua123 (2015-2-14 22:31:06)
首先电泳检测模板和引物有没有降解,如果没有降解扩增时做个阴性对照看酶是否还有活性,相信以上的问题不是问题,那么扩增自然也不是问题了
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