【求助】恳求各位高手和经验人士给与帮助

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-2-15 16:03 作者: gmjghh 来源: 分析测试百科网

大家好！这是我前几天做的跑的电泳图。2000的Marker，图中7、11号中大于2000的片段是我想要的，小片段是非特异扩增。pcr反应条件为95℃预变性5min; 94℃变性30s，50℃退火40s，72℃延伸3min，35个循环;72℃延伸5min
我做的是细菌，祝福法提DNA,用一对引物扩增可变区（目的片段大小不定，但至少大于2000）酶我用的宝生物普通Taq酶，合成引物退火温度分别57℃、59℃
本来我想优化下反应条件以得到特异量更多的产物，可是没想到就再也做不出来了。现在做PCR真能得到小于700的非特异条带了，我尝试过重新提模板、新配引物、降低退火温度等，可均失败了。欲哭无泪啊，求各位高手帮助！

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leifengta (2015-2-15 16:03:34)

楼主可以按照TAKARA手册上的做法试一试。1.想提高特异性可以适当提高退火温度，50度的时候引物容易接上但是相对来说特异性不高，按TAKARA的手册，在55度退火30秒比较合适。2.楼主现在的延伸时间理论上是够了，可能是实际上还不够，所以导致扩出来的只有小片段，大片段还来不及扩，可以再延长1min左右。我做过4000bp不到的片段，要延伸6min才扩得出。拙见。祝顺利。
hyuu (2015-2-15 16:03:49)

看下体系是否污染，不加模板
wanglaoshi (2015-2-15 16:04:04)

换酶，特应性高的酶
gmjghh (2015-2-15 16:04:26)

非常感谢楼上朋友的帮助。我的另一对引物（和图中的引物不同，但目的基因也是可变大小）用这种酶可以扩增出2000bp以上的条带，虽然特异性不是很好，但是条带还是挺亮的。
我打算明天再次重提模板试试看，并加水做对照，结果明天告知大家。
祝自己好运！
101010 (2015-2-15 16:04:39)

感觉楼主在提取RNA！
remonte (2015-2-15 16:05:06)

嗯，可以换个酶试试~~
gmjghh (2015-2-15 16:05:24)

谢谢大家的帮助，我今天新提取了模板，用原条件做了pcr,加了阴性对照，跑电泳发现阴性对照只有些引物二聚体，这应该可以排除污染吧
只是其它的依旧是目的条带没有，非特异性条带亮亮的，苦恼
gmjghh (2015-2-15 16:09:17)

第3、4、5泳道的为同一株菌的DNA只是加的浓度不一样
xingyi08 (2015-2-15 16:10:07)

出现非特异性扩增，有六方面原因：引物特异性差，模板或引物浓度过高，镁离子浓度高，退火温度偏低，循环次数过多，酶量过多。分析来看，应该是你的退火温度偏低，建议：退火54或55摄氏度45秒，延伸时间改为2min30s即可。另外，想知道你的反应体系？是不是酶量偏多造成的。