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【求助】RT-PCR没有条带

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-2-15 16:20    作者: www.1    来源: 分析测试百科网

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【求助】RT-PCR没有条带

我跑pcr三个月了,提细胞总RNA,反转录之后pcr,每次都只有内参出现,目的条带一次都没有.我的目的条带全长2440bp,用taq plus没有做出来,后面换long taq也没有结果.然后在文献中看了可以先扩一个短的看看有不有,结果还是没有条带,做了touchdown 从60度降到45度,引物的tm值是50度,(引物合成公司给的),但是用primer5分析tm是58度.很奇怪.怎么办啊?换了很过酶都没有用.

后面分析模板是属于高GC含量的模板，一般酶跑步出来，换了配套的GCbuffer就做出来了。
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最新回复

  • bgf5 (2015-2-15 16:20:38)


    模版降解了？
    重新提RNA，做逆转录看看！

  • www.1 (2015-2-15 16:20:59)

    可是模板降解了,那内参怎么会有呢?

  • NBA (2015-2-15 16:21:15)

    1.RNA的质量并不是简单通过内参就能判断。
    2.反转的效率如何，所用何种反转酶。
    3.反转所用引物为dT或random primer?
    4. 是已知基因还是未知的？
    5.引物设计位点是靠近5‘位置还是3’位置？
    6.既然引物Tm值是50度，为什么要从60度来做touch down？

  • superboy (2015-2-15 16:21:46)

    QUOTE:

    原帖由 NBA 于 2015-2-15 16:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    1.RNA的质量并不是简单通过内参就能判断。
    2.反转的效率如何，所用何种反转酶。
    3.反转所用引物为dT或random primer?
    4. 是已知基因还是未知的？
    5.引物设计位点是靠近5‘位置还是3’位置？
    6.既然引物Tm值是50度，为什么要 ...
    请问用引物dT或random primer反转有何不同呢?

  • whitesheep (2015-2-15 16:22:15)

    我现在也出现这样的情况了，请问楼主解决了吗 ？

  • woshituzhu (2015-2-15 16:22:43)

    楼主你用的引物是特异性引物还是随机引物还是说RACE技术？

  • www.1 (2015-2-15 16:23:10)

    QUOTE:

    原帖由 whitesheep 于 2015-2-15 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    我现在也出现这样的情况了，请问楼主解决了吗 ？
    换GCbuffer成功跑出来了。

  • www.1 (2015-2-15 16:23:48)

    我的是模板GC含量太高了，换对应的BUFFER就行了。

  • www.1 (2015-2-15 16:24:09)

    我遇到和你一样的问题，现在还是没有好的办法，你能给些建议吗？

  • www.1 (2015-2-15 16:25:21)

    模板没有问题的话，也就是内参可以出来，那就是先跑个touchdown，看看有不有条带，这一步可以说明不是温度的问题，还有引物不能有降解，这些有没问题的话那你分析一下模板是不是跟我的一样是复杂模板吧。

  • youyou99 (2015-2-15 16:26:00)

    QUOTE:

    原帖由 www.1 于 2015-2-15 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    模板没有问题的话，也就是内参可以出来，那就是先跑个touchdown，看看有不有条带，这一步可以说明不是温度的问题，还有引物不能有降解，这些有没问题的话那你分析一下模板是不是跟我的一样是复杂模板吧。 ...
    恩，按照你的方法尝试了，最后还是出结果了，非常感谢！

  • ROSE李 (2015-2-15 16:26:31)

    你好，我也遇到了内参扩出来，目的基因阔步出来的情况，我的CG含量是65%的，请问是不是我也应该用GC Buffer试一试呢？请问你用GC Buffer退火温度提高了多少呢？我用的Takara的Ex TAQ，是应该用Buffer1 还是Buffer 2呢？

  • www.1 (2015-2-15 16:27:05)

    QUOTE:

    原帖由 ROSE李 于 2015-2-15 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    你好，我也遇到了内参扩出来，目的基因阔步出来的情况，我的CG含量是65%的，请问是不是我也应该用GC Buffer试一试呢？请问你用GC Buffer退火温度提高了多少呢？我用的Takara的Ex TAQ，是应该用Buffer1 还是Buffer 2呢？ ...
    gc含量高于60%就需要用gc buffer了。宝生物有专门做高GC的酶，叫HS 什么哦，我记不清了。你可以查一下。

  • ROSE李 (2015-2-15 16:27:33)

    QUOTE:

    原帖由 www.1 于 2015-2-15 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    gc含量高于60%就需要用gc buffer了。宝生物有专门做高GC的酶，叫HS 什么哦，我记不清了。你可以查一下。
    嗯，是的，除了用GC Buffer我还对比了一下Ex Taq和La Taq做RT-PCR，我做的La Taq+GC 1没有问题但是Ex +GC就有杂带，但是EX+GC 1做菌落PCR还是挺好的。谢谢楼主，另外换做高保真克隆我用的GXL，做出来的条带还不错，对于我个人的实验来说，它比用La Taq退火温度降低了4度P出来的，毕竟用La Taq要求退火温度稍高，现在貌似GXL比HS用的多在我们这边……感谢楼主^ ^

    PS：以上包括我的一点点实验心得，希望能和楼主继续讨论（= =然后补充一下我的总体GC含量是65，局部有120bp的GC含量是72%）

  • birdfish (2015-2-15 16:28:00)


    请问你用的“GCbuffer”是从哪个公司买的？
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