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【求助】急求高手指教!PCR产物扩不出
我现在做pcr时遇到一些问题,我用的有一对引物是之前师兄已经做过的,现在我用相同的引物和PCR条件做出的结果却非常不理想,扩增效率很低,条带有很暗,酶切根本做不出来。我自己重新跑的梯度做出来的效果还是很差。这对引物是上游5'-GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAA GAC C-3' ,下游 5'-CTC CTT AAC GTA CTG GGA AGC-3'。PCR原反应条件:95℃预变性5分钟,95℃变性25秒,60℃退火40秒,共35个循环,终末延伸:72℃延伸10分钟。新的条件是预变性95℃,5min、变性95℃,30s、退火55℃,30s、延伸72℃,30s,共35个循环,最后72℃再延伸10min。【求助】急求高手指教!PCR产物扩不出
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最新回复
kuaizige (2015-2-15 17:10:36)
yes4 (2015-2-15 17:10:52)
酶失活啦?做一个对照噜~
箭头儿 (2015-2-15 17:14:18)
ero11 (2015-2-15 17:14:42)
阳性对照是关键 否则谁也说不出为何
jude (2015-2-15 17:15:24)
目的片段大小没说啊。延伸时间跟目的片段大小相关,30sec只够延伸500bp的。还有退火温度可以再降到50度,50度的时候引物容易接上去。template的DNA的浓度也有关系,一般250-500ng。PCR还是很敏感的。
am10 (2015-2-15 17:15:44)
iii_ii (2015-2-15 17:16:08)
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如果目的片段是2K左右,那么延伸时间应该设置多久呀?O(∩_∩)O谢谢~
guagua (2015-2-15 17:16:38)
jude (2015-2-15 17:16:58)
请问你的PCR扩出来了吗?我最近也是扩不出来,用反转录的cDNA作为模版,Actin能扩出来,我的目的片段也扩出来过,不过很弱,在紫外下能看到有条带,没办法做酶切,请大家指点!
chenshuanhe (2015-2-15 17:17:27)
XYZQ (2015-2-15 17:17:57)
加5%的MgCl2(25mM)试试
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