【求助】帮忙看一下哪里出了问题

最新回复

• iii_ii (2015-2-15 17:44:27)

  感觉是你引物特异性不够高的原因，你提高点退火温度试试，每2度一个梯度，做个梯度

• 菠萝喵 (2015-2-15 17:44:46)

  QUOTE:

  原帖由 iii_ii 于 2015-2-15 17:44 发表
  感觉是你引物特异性不够高的原因，你提高点退火温度试试，每2度一个梯度，做个梯度

  退火梯度做过了，坐了12个温度梯度发现都有不同程度的拖带，不过后面虽然拖带不明显但目的条带的亮度又比较低

• jujuba (2015-2-15 17:45:01)

  
  怎么做梯度？求教。

• 米囡 (2015-2-15 17:45:22)

  
  我们实验室也出现过这种问题，但是分析可能跟酶有关系！

• flyxx05 (2015-2-15 17:45:42)

  
  做个对照实验，看到底是酶，buffer，模版。。。哪出的问题。因为你说以前是很漂亮的，所以怀疑是实验体系中某一成分出现了问题。不过还是先确定一下你的模版有没有问题
  

• october7 (2015-2-15 17:45:59)

  
  同意六楼的意见，先确认一下模版的质量

• 101010 (2015-2-15 17:46:15)

  感觉条带蛮锐的啊，但是拖尾这么严重。。。模板是不是有问题啊
  

• fangxiang (2015-2-15 17:46:33)

  
  这个我感觉是你的模版有问题。

• 菠萝喵 (2015-2-15 17:47:03)

  QUOTE:

  原帖由 flyxx05 于 2015-2-15 17:45 发表
  
  做个对照实验，看到底是酶，buffer，模版。。。哪出的问题。因为你说以前是很漂亮的，所以怀疑是实验体系中某一成分出现了问题。不过还是先确定一下你的模版有没有问题
  ...

  嗯，应该做个对照组看看哪里出了问题，最近用其他引物做了梯度效果就好很多，拖带不是那么强而且目标条带更亮一些。

• 菠萝喵 (2015-2-15 17:47:21)

  上图就是我做的两种引物的退火梯度（同一样本DNA），标示为引物1的（左边）就是这次的扩增产物，拖带明显，而右边的引物2效果就好一些，所以感觉上来说多半是引物的问题。

  
  剃度检测3.jpg

• 菠萝喵 (2015-2-15 17:49:10)

  怎么做梯度？求教。
  
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  我用的是伯乐PTC 200扩增仪做的梯度，体系用的是混合的MIX,主要条件如下：
  
  反应条件：预变性95°-5 min
                  变性95°-5min
                  退火(56°-72°)-45sec
                  延伸72°-45sec（33循环）
                  再延伸72°-5 min
  
  反应体系： MIX=10微升  引物各0.5微升  ddH2O=8微升  样本DNA=1微升；总共是20的体系，要做25的体系的话把MIX改成12.5微升，dd水改成10.5微升即可，其他条件不变。
  
  PS：其中样本DNA为各个样本的混合物，通常各取2-5微升装在一起混匀，这样子就防止了DNA对检测结果的影响，只有退火温度可以改变实验结果。而且退火范围我设计的是56°到72°，基本涵盖了所有可能的退火温度，这个不一定，可以改动，你只要在仪器中设置初始和终止退火温度便可，中间的递增值是随机的，PCR仪器会自动给12列的Block分配好温度， 不过要记录一下，搁置样品时候注意摆放顺序（从左至右一次提升）。祝你好运！

• 2541 (2015-2-15 17:49:33)

  嗯，应该做个对照组看看哪里出了问题，最近用其他引物做了梯度效果就好很多，拖带不是那么强而且目标条带 ...
  
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  从这次的结果看来，引物1的确没有引物2好用。

• vcve (2015-2-15 17:49:48)

  是不是印务的特异性不强啊？还有可能是体系中Mg2+的浓度不太合适。

• bgf5 (2015-2-15 17:50:04)

  原来是引物啊，太多因素干扰PCR了

• bongte (2015-2-15 17:50:20)

  
  呵呵，感觉是模板降解了，或者是提取的质量不高哦。