【求助】求pcr产物连接转化失败原因

最新回复

• daod (2015-2-16 10:37:06)

  我一般是将扩增后的PCR产物用Gel Extraction Kit 回收，连接PMD19-T载体,16度连接过夜。
  不管是哪个载体一般连接体系不会有问题，如果片段长的话连接过夜时间足够。你可以跑个电泳看看回收的DNA怎么样。

• uuooii (2015-2-16 10:37:27)

  
  这样的情况就加个阴性和阳性对照吧
  看看问题出在什么环节

• dream2013 (2015-2-16 10:37:50)

  
  提取之后 再PCR一次看看

• 嗅嗅 (2015-2-16 10:38:52)

  
  这种情况很正常啊，不知道你用的是什么Taq酶，有的酶拉出来的PCR片段是钝末端的，需要两端加A后才能连入T载体的。

• quiqui008 (2015-2-16 10:39:10)

  
  从感受态和转化上找原因

• sistis (2015-2-16 10:39:30)

  
  转化不成功就啥也不长了，应该全是白斑或蓝斑啊？我也遇到了同样的问题，大家想想办法啊！！！

• nikonun (2015-2-16 10:39:53)

  
  看来连接转化问题多啊，我也正在连接转化中纠结着。郁闷，蓝斑都没长几个，白班根本没有……

• u76mp (2015-2-16 10:40:31)

  
  连T载体要用普通的taq酶PcR 可以在两端加A  ，而pfu taq酶就不能加上A 所以不能连T载体 。片段太大也不好连。

• sr9971 (2015-2-16 10:41:07)

  在PCR出来的产物做连接，做了试剂盒中的对照，对照的效果很明显，由于我的PCR产物做了胶回收。现在出现的问题是蓝斑少，白斑更少。感受态也没有问题。准备做下直接PCR不胶回收做一次，如果还不行的话，就应该是DNA纯度问题，在DNA里有抑制连接的物质，但是不知道腐殖质对连接有多大的影响。高手指点下。

• biabiade (2015-2-16 10:41:36)

  
  我的转化也不成啊，郁闷中。热击的42度是严格要求的吗？是不是所以的TAQ酶都可以自动加A的，酶连接的效率低是怎么回事？

• wood533 (2015-2-16 10:41:55)

  有的taq酶带A，有的不带A，说明书上都应该有的。
  

• pulala (2015-2-16 10:42:17)

  
  有可能链接体系~~~不知道你目的基因PCR的时候是用普通的，还是两边加个A形成粘性末端滴呢~~~TA克隆呀~~