【求助】 PCR条件的设计

最新回复

• dreaming (2015-3-10 14:22:43)

  
  变性一般94-96度，这个温度是把双链DNA打开，而退火是引物与模板结合一般55-65度，具体的温度根据你的引物的Tm值来确定，一般使用60，延伸温度是根据酶来确定的，Taq酶的最佳活性温度是72度，所以Taq酶72度延伸；而pfu高保真酶的最佳活性温度是68度，所以68度延伸
  希望对你有用！

• kewanqi2011 (2015-3-10 14:23:08)

  可以去生物论坛上找资源  很多的    楼上说的很对

• nikonun (2015-3-10 14:23:25)

  
  热变性的目的是将双链DNA解链为单链DNA，使在引物与模板能够退火为双链，延伸是再上面的基础上DNA Polymerase进行的聚合反应；而热变性的温度大多采用93~95℃（Taq酶在95℃的半衰期只有20min，94℃的半衰期是40min，大多数都采用94℃），在这个温度下dsDNA完全能够解链为dsDNA；退火的温度要根据引物的Tm值而定，一般采用Tm-3~5℃的温度做退火（其实Tm值仅仅是个参考，还和引物的结构有关）；延伸温度是由你使用的聚合酶而定，普通的Taq酶的话就用72℃就可以了。
  希望对你有所帮助!

• 49888 (2015-3-10 14:23:44)

  主要是退火温度和延伸时间，退火温度有引物决定，延伸时间由扩增片段大小决定
  
  [ 本帖最后由 49888 于 2015-3-10 14:25 编辑 ]

• u234 (2015-3-10 14:25:56)

  变的只有两个嘛。。。退火温度（比Tm小5°），二是延伸时间（据说按照1000bp：1分钟这个比例计算），，，，其他都基本一样滴啦~~如果你不知道引物对应的退火温度，需要探索，建议温度梯度PCR，来探索最佳条件~~