【求助】CR结果都是拖带是什么原因

最新回复

• 831226 (2015-3-11 14:47:01)

  你的那个marker是正常的 应该不是胶不好 考虑目的片段被降解了

• wanglaoshi (2015-3-11 14:47:17)

  如果其他的都是好的的话，那么说明你的体系没问题，要么考虑模板降解，或者太浓，还有引物问题，引物没问题的话，确定pcr程序，在没问题就把引物做个梯度，要再不行就重新提模板
  

• nikonun (2015-3-11 14:47:38)

  
  你的引物和模板是不是反复冻融了？
  反复冻融会导致模板和引物发生降解，引物和模板最好是分装后冻存，如果最近一直使用可以放4℃冰箱，保存一年没有问题

• bongte (2015-3-11 14:47:55)

  不是楼上的原因就是引物特异性太差，重新设计引物或提高退火温度试试

• 12xunmei (2015-3-11 14:48:20)

  
  很有可能是引物特异性不高，我曾经遇到过。

• coolcool (2015-3-11 14:48:43)

  QUOTE:

  原帖由 nikonun 于 2015-3-11 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的引物和模板是不是反复冻融了？
  反复冻融会导致模板和引物发生降解，引物和模板最好是分装后冻存，如果最近一直使用可以放4℃冰箱，保存一年没有问题 ...

  引物和模板天天用着，放-20度的，用不多久。

• vera+ (2015-3-11 14:49:04)

  应该是引物问题，设计估计不对

• xue258 (2015-3-11 14:49:26)

  拖尾的原因太多了。两方面吧。
  1、看你的胶、缓冲液。判断依据如果MARKER很清晰，说明是原因（2)。否则都有可能。
  2、那就是从你的PCR结果的产物分析了。楼上都有提到过的引物的特异性不好、退火的温度不是最优的、循环次数、dNTP的浓度，Mg离子的浓度都会有影响。总之一句话可能造成PCR的非特异性产物过多的都会拖尾。
  当然也有可能是你操作的原因：上样时样品漂了、电压太高、电泳缓冲液TAE或者TBE的污染、胶的浓度大小、还有可能是你泡EB的时间过长，太多了自己对照下吧。

• TAT (2015-3-11 14:49:47)

  我也遇到过这样的情况，我做了一个退火温度的梯度，发现降低了2度反而更好了，也要换换引物

• wanglaoshi (2015-3-11 14:50:11)

  我曾经因为PCR某个试剂污染了，出现了拖带。。

• memory (2015-3-11 14:50:27)

  
  目的片段降解了

• 3648755 (2015-3-11 14:53:20)

  
  引物特异性不够，考虑增加退火温度或引物浓度

• 9妖9 (2015-3-11 14:53:40)

  
  如果是新鲜的PCR产物直接跑胶，不考虑降解问题，就可能是因为你的引物特异性不好，模板质量也不高，其实看maker，说明胶应该还是有一点问题，但主要问题不是这个

• uaubc (2015-3-11 14:53:57)

  
  是不是引物的问题

• youreyes (2015-3-11 14:54:16)

  有可能是模板浓度过高，调节一下浓度

• youreyes (2015-3-11 14:54:42)

  
  优化一下PCR条件和各个反应成分的浓度

• 7437654 (2015-3-11 14:55:01)

  
  1、引物特异性不好2、模板浓度高3、产物降解

• chuntian1983 (2015-3-11 14:55:21)

  
  我实验中也遇到了这种情况， 在那个温度上下两度做了梯度筛选，结果发下高温时就不会出现这种情况了，你可以试试

• one (2015-3-11 14:55:39)

  
  其实，你的marker并不是很好（也有拖带的痕迹吧……），应该是胶浓度稍低了点。
  然后，marker左边的引物二聚体明显，所以体系的引物偏多。
  拖带的原因应该是模板量多了。但也许是你的模板本身质量不好，比如其浓度和纯度等。
  PCR反应涉及的参数很多，反应条件注意事项也很多，但反应条件并不是太苛刻的东西。在保证所用材料有效后，扩增出目的条带还是比较容易的。

• coolcool (2015-3-11 14:56:05)

  嗯。。。多谢各位帮我认真分析了！
  各方面我也都考虑后，觉得最有可能还是模板的问题了。
  我这个是流感病毒的模板，合成cDNA的时候用的是随机引物，可能不太好扩吧。我老师也建议我用流感的通用引物合成cDNA试试！希望能把我想要的基因顺利P出来!