【求助】SYBR实时荧光定量PCR结果分析

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• mod=8048 (2015-3-11 17:15:21)

  
  貌似要做绝对定量的  标准曲线？

• ukonptp (2015-3-11 17:15:38)

  QUOTE:

  原帖由 mod=8048 于 2015-3-11 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  貌似要做绝对定量的  标准曲线？

  我做的是相对定量的，所以只需要做一次标准曲线~

• 3648755 (2015-3-11 17:15:54)

  
  个人觉得是浓度问题 我也碰到过类似情况，就是说你用的引物浓度已经无法使第四个浓度和后面的浓度梯度之间产生差异，可能是DNA浓度太低或者你稀释后面低浓度梯度没有稀释好

• am10 (2015-3-11 17:16:16)

  后面的模版浓度太低导致的！

• ritou1985 (2015-3-11 17:16:46)

  
  后面的模版浓度太低导致的！

• ukonptp (2015-3-11 17:17:08)

  QUOTE:

  原帖由 3648755 于 2015-3-11 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  个人觉得是浓度问题 我也碰到过类似情况，就是说你用的引物浓度已经无法使第四个浓度和后面的浓度梯度之间产生差异，可能是DNA浓度太低或者你稀释后面低浓度梯度没有稀释好 ...

  谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
  PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。

• ukonptp (2015-3-11 17:17:27)

  QUOTE:

  原帖由 ritou1985 于 2015-3-11 17:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  后面的模版浓度太低导致的！

  谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
  PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。

• HP007 (2015-3-11 17:17:52)

  QUOTE:

  原帖由 ukonptp 于 2015-3-11 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  谢谢你的帮助，我想请问，如果是DNA浓度太低，有什么方法可以解决？
  PS：因为组织样品的量很少，所以提取的总RNA量很少。

  你可以反转过来，之后用你的引物以cDNA为模版扩增，然后胶回收，用胶回收产物做标准曲线。

• ukonptp (2015-3-11 17:18:33)

  QUOTE:

  原帖由 HP007 于 2015-3-11 17:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你可以反转过来，之后用你的引物以cDNA为模版扩增，然后胶回收，用胶回收产物做标准曲线。

  我已经使用的是胶回收产物跑的标准曲线，电泳跑出来的目的条带很亮，如果回收时最后一步加入的溶解液少一些，会不会使浓度达标呢？谢谢你~~

• HP007 (2015-3-11 17:19:10)

  QUOTE:

  原帖由 ukonptp 于 2015-3-11 17:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我已经使用的是胶回收产物跑的标准曲线，电泳跑出来的目的条带很亮，如果回收时最后一步加入的溶解液少一些，会不会使浓度达标呢？谢谢你~~

  嗯，可以的，就是洗脱液加少点不就浓度大了吗？稀释的时候一定要稀释好，要不做出来的很乱。你可以从原液、稀释10、100、1000等等做。还有可能是不是你引物浓度低了，那时候引物已经不够用了呢！

• uaubc (2015-3-11 17:19:46)

  
  也要注意下试剂盒，有些公司的试剂盒线性范围较小，敏感性不好，模板浓度低了，就检测不到了。

• ukonptp (2015-3-11 17:20:05)

  QUOTE:

  原帖由 HP007 于 2015-3-11 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  嗯，可以的，就是洗脱液加少点不就浓度大了吗？稀释的时候一定要稀释好，要不做出来的很乱。你可以从原液、稀释10、100、1000等等做。还有可能是不是你引物浓度低了，那时候引物已经不够用了呢！ ...

  谢谢你的帮助，我今天将回收的产物从添加30ul的ddH2O，改成了10ul的ddH2O，跑出来的曲线还是和这次的一样，下次我试试增加引物浓度~

• ukonptp (2015-3-11 17:20:40)

  QUOTE:

  原帖由 uaubc 于 2015-3-11 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  也要注意下试剂盒，有些公司的试剂盒线性范围较小，敏感性不好，模板浓度低了，就检测不到了。

  好的，谢谢你的帮助，我先试一下增加引物浓度~

• lgm (2015-3-11 17:21:27)

  
  ct值在20循环不像是模板浓度导致的哦·   稀释的问题吧？

• wanglaoshi (2015-3-11 17:21:47)

  应该不是浓度太低，你的ct 才20几 还没到30 呢，20几已经相当的高了。一般35ct以下都是可以跑出来的。有可能是你的试剂或者机器有问题

• bongte (2015-3-11 17:22:17)

  
  一般出现这种情况，可以认为是你稀释到第五个及其以后，浓度太低，已经检测不到了。看图你应该是10倍稀释的吧。但是你这里也有个矛盾的地方，一般在Ct25左右，含量应该还是很高的。理论上讲是不应该出现这种图的。