【求助】请大家帮我分析一下qPCR程序应该怎么优化？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2015-3-11 17:31 作者: lyxsqs 来源: 分析测试百科网

小弟最近刚刚接触qpcr很多地方不懂想向大家请教一下，昨天刚做的qPCR出现了引物2聚体和双峰现象，请大家帮忙分析一下。qPCR是用ABI7500，一下程序做的：95℃ 10min，95℃ 15S，55℃ 30S，72℃ 40S ，40个循环做的。我的普通PCR用30个条带跑的很好是单一条带，除了循环数程序都一样，PCR体系也是一样的。我的DNA是从土壤中提取的，引物是专门扩增pmoA基因的引物。请大家帮忙分析一下，在线等。

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【求助】请大家帮我分析一下qPCR程序应该怎么优化？

Melt Curve.jpg

普通PCR.jpg

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8princess8 (2015-3-11 17:31:34)

不知道貌似我还没出现这个情况
lyxsqs (2015-3-11 17:31:52)

QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2015-3-11 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
不知道貌似我还没出现这个情况
我都做了好久了，优化了很多次，只有30个循环结果好点
redbutterfly (2015-3-11 17:32:16)

琼脂糖的分辨力很低，可以提高退火温度尝试
lyxsqs (2015-3-11 17:32:42)

QUOTE:
原帖由 redbutterfly 于 2015-3-11 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

琼脂糖的分辨力很低，可以提高退火温度尝试
提高了不管用！我从55度一直上升到65度，55度P的最亮！
TAT (2015-3-11 17:33:05)

把退火温度提高一些，太低会影响的。
kuaizige (2015-3-11 17:33:38)

可以换引物试试吧，多态性扩增，扩增的片段和目的片段大小差不多，所以跑胶分辨不出来！
caihong (2015-3-11 17:33:53)

循环数偏多了，最好35cycles以下，峰太多，底物不单一，引物特异性差
caihong (2015-3-11 17:34:13)

QUOTE:
原帖由 lyxsqs 于 2015-3-11 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

提高了不管用！我从55度一直上升到65度，55度P的最亮！
最亮也并不一定代表那就是最好的扩增模式，只能说明体系采用这个退火温度，扩增效率最高，但它的特异性并不能保证，咱们是做荧光定量，并不是需要产生多好的目的基因产物，只要没有非特异性扩增，CT值合理就行了。假如那第二个峰代表的是二聚体的话，那就适当降低引物溶度，要是它代表非特异性产物的话，只能提高退火温度进行尝试，可以直接进行qPCR尝试。
lyxsqs (2015-3-11 17:34:28)

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原帖由 caihong 于 2015-3-11 17:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

最亮也并不一定代表那就是最好的扩增模式，只能说明体系采用这个退火温度，扩增效率最高，但它的特异性并不能保证，咱们是做荧光定量，并不是需要产生多好的目的基因产物，只要没有非特异性扩增，CT值合理就行了。假如那第二个峰 ...
嗯！我做了普通的PCR温度梯度，效果都不是很明显！我打算先降低引物浓度先，看看情况！然后再做个温度梯度看看！
whitesheep (2015-3-11 17:34:52)

1、引物设计很重要，建设重新设计；
2、琼脂糖电泳明显可以看到杂带
3、调节模板、引物浓度，合理的浓度梯度预实验很重要
4、退火温度提高，
5、并不是得到最亮条带的条件就最好，即使条带再亮，却有杂带，无用
阿k (2015-3-11 17:35:10)

QPCR很灵敏，你这有非特异性扩增！先用引物来个阴性对照，看下溶解曲线！
fangxiang (2015-3-11 17:35:29)

非特异性产物太多
lyxsqs (2015-3-11 17:35:55)

QUOTE:
原帖由阿k 于 2015-3-11 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
QPCR很灵敏，你这有非特异性扩增！先用引物来个阴性对照，看下溶解曲线！
做了，都重叠在一起了！NTC有引物2聚体的锋，比较奇怪我看别人相同引物做出来的都是一条基线。
lyxsqs (2015-3-11 17:36:43)

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原帖由 fangxiang 于 2015-3-11 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

非特异性产物太多
就是有很多才想让大家出出主意优化一下！
october7 (2015-3-11 17:37:04)

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原帖由 lyxsqs 于 2015-3-11 17:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

做了，都重叠在一起了！NTC有引物2聚体的锋，比较奇怪我看别人相同引物做出来的都是一条基线。
我没有明白你说的做了，都重叠在一起是什么意思？别人用相同的引物做的事好的，那就说明你提的DNA里面有这个引物结合的位点啊！
lyxsqs (2015-3-11 17:38:03)

NTC我做了，现在单独帖出来了。我比较纳闷的就是NTC溶解曲线为啥会出现二聚体的峰。

NTC Melt Curve.jpg