【求助】如果一个引物对的两条引物的Tm值不一样，PCR中...

最新回复

• jude (2015-4-01 16:48:29)

  QUOTE:

  原帖由 fei1226com 于 2015-4-1 16:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  请教各位师兄师姐：如果一个引物对的两条引物的Tm值不一样，pcr中的Tm值应该参照那个呢？是比较高的还是比较低的？多谢！

  低的

• IAM007 (2015-4-01 16:48:45)

  
  我觉得你最好用温度梯度来先确定最适的退火温度，这样就可以节省时间。

• feiya (2015-4-01 16:48:59)

  
  温度梯度？什么意思呢？多谢啊？

• dog002 (2015-4-01 16:49:16)

  touchdown就是每一个循环降低一点温度，最后到达目标温度大量扩增，可以百度搜索具体操作

• dog002 (2015-4-01 16:49:37)

  温度梯度是某些PCR仪器带的功能，随着列数的不同，温度有变化

• mimili_901 (2015-4-01 16:49:58)

  
  我们一般是取平均值！最好是做个梯度

• xue258 (2015-4-01 16:50:16)

  
  一般取低的

• 圆圆圈圈 (2015-4-01 16:50:52)

  最好做梯度，我就是这样做的

• 大白菜 (2015-4-01 16:51:18)

  取低的吧

• caihong (2015-4-01 16:51:35)

  感觉用低的好点，不过最好做个梯度PCR

• wood533 (2015-4-01 16:52:58)

  江湖告急更换即可很快就回家看了

• 2541 (2015-4-01 16:53:17)

  
  1.退火温度=Tm-（3~5℃）
  2.做温度梯度

• 一叶 (2015-4-01 16:53:40)

  
  Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。
  
  该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。
  
  该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行“Touchdown PCR”。由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。
  
  该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆和测需一打PCR产物，将可以确定肽的正确编码序列，设计进行杂交的寡核苷酸等。该技术特别适用于由Ser，Lys和Arg（每个有6个密码子）构成的多肽。
  
  用primer premier来计算引物Tm值，退火温度设计为从Tm+5度降落至Tm-10度，每度2个cycle，最后在tm-10度上增加5-10个cycle.例：Tm为58度，则从63度降落到48度，每度2个cycles,最后在48度加5-10个cycles. 　　
  
  原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。 　　
  
  但是，退火温度TOUCH DOWN无法改善扩增效率低的问题，一般用于在杂模板中提高扩增特异性。

• 吴才子 (2015-4-01 16:53:57)

  
  如果你的引物很常用  很经典的话，不需要刻意去追求退火温度，选55℃都可以，如果不是很好的引物的话，最好做个touchdown

• 蒲公英 (2015-4-01 16:54:17)

  
  还是做个梯度比较好！

• 蓝蝴蝶 (2015-4-01 16:56:25)

  我一般是按照最低的来，慢慢再升

• 蓝蝴蝶 (2015-4-01 16:56:25)

  我一般是按照最低的来，慢慢再升

• 阿敏 (2015-4-01 16:58:13)

  要确定好的条件，还是做梯度比较好！