【求助】两个引物的Tm值相差太大

最新回复

• yizhi (2015-4-28 09:55:00)

  引物一开始设计就出问题了，两个引物TM应该相差不要超过2度，你这可以试一试拿59度那个引物降低2-5度扩增

• fox_79 (2015-4-28 09:55:20)

  QUOTE:

  原帖由 yizhi 于 2015-4-28 09:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  引物一开始设计就出问题了，两个引物TM应该相差不要超过2度，你这可以试一试拿59度那个引物降低2-5度扩增

  试过了，普通PCR时P不出来的！

• yizhi (2015-4-28 09:55:56)

  QUOTE:

  原帖由 fox_79 于 2015-4-28 09:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  试过了，普通PCR时P不出来的！

  那试试梯度，上下差十度吧

• 131415 (2015-4-28 09:56:25)

  
  跑个梯度试试看，我的tm是59度，不过最好的温度却是63度

• fox_79 (2015-4-28 09:56:47)

  差这么大，不过我们实验室没有梯度PCR仪！哎

• kulee (2015-4-28 14:00:04)

  
  可以试试降落pcr！！

• fox_79 (2015-4-28 14:17:35)

  已经试过了，还是不行！P不出带来！

• newway (2015-4-28 14:19:59)

  
  重新设计引物吧~~~~

• fox_79 (2015-4-28 14:21:12)

  恩，正在设计中，但是不晓得怎么样设计才可以避免二聚体和发卡结构？

• yizhi (2015-4-28 14:21:37)

  两个引物是指上游引物和下游引物的TM吧？不是说的内参照和目的基因的引物吧？这个我在设计引物的时候也没考虑啊。
  切盼指导！不会我现在设计的引物也有问题吧。但我PCR跑胶后没有问题，条带都很清楚····

• jude (2015-4-28 14:24:04)

  降温试试看！！！

• veiwu (2015-4-28 14:29:15)

  是的，是指两个引物和目的基因的退火温度，这两个引物组成了一对引物，他们tm之间相差最好不要超过2度，这样在设置pcr退火温度时才比较好设置，一般是理论TM就是合成公司给的你的温度降低5度左右，你的相差太多了，有些问题，如果各种方法都试过了，不行的话，建议重新设计引物。内参引物如果你们用的在所做的物种上是成熟的内参引物，就不需要调整退火温度了，只需要调整循环数，我是我的观点。

• bs4665 (2015-4-28 14:50:28)

  用primer premier设计引物