【求助】大家PCR时引物终浓度一般选多少？

最新回复

• tewank (2015-7-01 22:07:23)

  
  10umol/L

• zzzz (2015-7-01 22:07:44)

  
  我一般是配成保存液为50uM，
  工作液就是将两个引物1：1一对，也就是25uM
  使用时加1ul混合引物于25ul体系，也就是终浓度1uM，好记好算
  不过不一定浓度合适，有时还需摸索
  祝好！

• zzzz (2015-7-01 22:08:04)

  
  10uM好像比较常用

• memory (2015-7-01 22:08:21)

  
  引物浓度过高会出现什么情况，我是用的20UM，谢谢回复

• memory (2015-7-01 22:08:47)

  
  下面的图是我昨天的结果，我是把我师姐已经做好的课题的引物拿来做预实验。反应体系及条件都是用她的。
  RT步骤：
  硫酸镁 2微升
  BUFFER 5微升
  去酶水 0.75微升
  dNTP 0.5微升
  RNase 0.25微升
  BCA 0.5微升
  OLIGO 0.5微升
  mRNA 0.5微升
  PCR步骤：
  硫酸镁 1.2微升
  BCA BUFFER 4微升
  灭菌蒸馏水 11.3微升
  Tag 0.1微升
  上游引物 0.5微升
  下游引物 0.5微升
  内参正义 0.2微升
  内参反义 0.2微升
  CDNA 2微升
  逆转录反应条件65度1分钟，30度5分钟，65度15-30分钟，98度5分钟，5度5分钟。
  PCR反应条件：94度5分钟，94度30秒，52度30秒，72度1分钟，35个循环。72度5分钟，4度保存。
  电泳是0.5XTBE 30ML加琼脂糖0.5G，100V电泳30分钟。
  我的引物是340BP，内参是500BP
  不知道为什么我的电泳会是这样的结果，都歪了，相当难看，而且目的条带没有，请各位大侠帮帮小弟！

  
  68779072.jpg

• 大海啊故乡 (2015-7-01 22:09:15)

  
  容易形成引物二聚体，就不易与目的片段发生退火。。。。

• memory (2015-7-01 22:09:37)

  那您觉得20UM浓度算不算高呢？

• memory (2015-7-01 22:10:03)

  
  SmallDonkey wrote:
  >不一定，要看使用的浓度、情况，还有不同的片段也不一样，模版不同差别也比较大(质粒最容易，基因组和cDNA则各有特点)
  >
  > 你使用时加多少？好像没有我加的多，应该问题不大
  >
  > only01 wrote:
  > >那您觉得20UM浓度算不算高呢？
  >
  >
  我的目的条带是340BP，内参是500BP，我用的引物浓度是20UM。一般内参跑出来而目的条带没出来主要是什么原因，模板？还是引物？谢谢回复
  内参出来说明模板质量没有问题，酶没有问题，PCR体系基本没有问题
  可能的原因：
  1。目的条带的引物设计，不过你的由于已经有人做出来，应该不是
  2。模板中目的片段的丰度，你是用基因组作模板还是cDNA?若是基因组也就没这个问题
  3。退火温度，可能需要摸一个梯度条件
  4。模板浓度，内参虽然出来，但可能是适用于该基因，也许也要摸个浓度梯度
  PCR的影响因素很多，具体会是什么原因不好判断，建议做好重复和对照，这样每次的实验结果才有意义
  祝好！
  > 我的目的条带是340BP，内参是500BP，我用的引物浓度是20UM。一般内参跑出来而目的条带没出来主要是什么原因，模板？还是引物？谢谢回复
  不用定量，做个倍比稀释，1-10000倍稀释，找几个稀释度就行
  > > 我是用的CDNA，不知道您说的模板浓度如何去摸，我这里没有RNA定量，提了RNA后直接加20微升DEPC备用的，没有测浓度

• 子衿青青 (2015-7-01 22:10:20)

  QUOTE:

  原帖由 tewank 于 2015-7-1 22:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  10umol/L

  uM和μM是不是一样啊请问？

• 子衿青青 (2015-7-01 22:10:55)

  QUOTE:

  原帖由 memory 于 2015-7-1 22:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  SmallDonkey wrote:
  >不一定，要看使用的浓度、情况，还有不同的片段也不一样，模版不同差别也比较大(质粒最容易，基因组和cDNA则各有特点)
  >
  > 你使用时加多少？好像没有我加的多，应该问题不大
  >
  > only01 wrote:
  > >那您觉得 ...

  uM和μM是不是一样啊请问？

• hold住 (2015-7-01 22:11:27)

  QUOTE:

  原帖由 子衿青青 于 2015-7-1 22:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  uM和μM是不是一样啊请问？

  其实就是μM，打字的时候图方便打成uM

• 子衿青青 (2015-7-01 22:12:50)

  容易形成引物二聚体，就不易与目的片段发生退火。。。。
  
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  uM和μM是不是一样啊请问？