【求助】如何提取贴壁细胞中的总RNA？

最新回复

• milkdog (2015-8-03 17:19:46)

  
  可以用TRIZOLA提，说明书应该有详细介绍的

• kewanqi2011 (2015-8-03 17:21:19)

  当然可以用TRIZol提了，步骤比提组织的还简单，若是在6孔板内养的细胞，处理时间到了以后，直接弃上清，用PBS洗2~3遍，把PBS弃净后直接加0.5~1.0mlTRIZol，裂解4~5min后将其移入无RNA酶的EP管中，-80度保存；或者是先常规的将细胞消化下来，PBS洗2~3遍，加TRAZol裂解。

• yonger (2015-8-03 17:21:41)

  谢谢大家！可以不用消化下贴壁细胞直接裂解吗？能充分裂解吗？
  请问用TRIZOL裂解时细胞的浓度大概是多少？是否需等细胞在6孔板中长满以后再加1mlTRIZOL？

• gmt (2015-8-03 17:22:30)

  
  绝对可以不用消化，直接裂解，我都做了N次了。细胞浓度和你养的细胞大小有关，有的细胞比较小，6孔板长满厚细胞数量能达到2-5×10的6次方，但若你养的细胞很不规则，单个细胞占的面积比较大的话，细胞数量就少了，一般作PCR 6孔板内的细胞就够了。细胞是否长满我觉得不是个问题，你在传代的时候细胞种的密度大一点，很快就长满了,留标本的时间是由你的处理因素决定的。

• dog002 (2015-8-03 17:25:12)

  请教一下：RNA怎么进行电泳？？

• chengjie79 (2015-8-03 17:25:34)

  今天用TRIZOL提了一次，12孔板长到80%后，加500ulTRIZOL裂解。异丙醇离心后看不到沉淀。加DEPC水溶解后检测260OD值几乎为0。证明根本没有提出来RNA。怎么回事？是细胞太少了吗？

• dior (2015-8-03 17:26:31)

  
  我今天做的同上楼,12孔板提取RNA,OD值也很小,不知道原因在何处,之前做6孔板比今天的结果好。哪位高手赐教一下,应该注意什么?谢谢!

• dior (2015-8-03 17:27:39)

  
  PBS是应该用DEPC水配制的，还是普通的就可以？

• DCS (2015-8-03 17:28:00)

  
  pbs应该是用DEPC水配制的。

• finger (2015-8-03 17:29:48)

  今天用TRIZOL提了一次，12孔板长到80%后，加500ulTRIZOL裂解。异丙醇离心后看不到沉淀。加DEPC水溶解后检测260OD值几乎为0。证明根本没有提出来RNA。怎么回事？是细胞太少了吗？
  除了细胞少，还跟你的提取过程有关，24孔板长满的的话，能获取的细胞量约10的6次访，按说也能提出来，因为我呈提过人的PBMC中的RNA，分离后得到的PBMC可能还没有10的6次访呢？但也提出来了，当你觉得细胞量少时，最后加DEPC水溶解时就少加点（加10ul左右）我觉得你最后用6孔板提，若是新手，细胞量又很少，提不出来也很正常！我给你发一个我提RNA的步骤，你可以试一试！

• finger (2015-8-03 17:30:08)

  
  样品RNA的抽提
  ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
  ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30°C孵育2到3分钟。4°C 下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
  ③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后4°C孵育10分钟后，于4°C下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
  ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC H2O配制，最好现用现配），清洗RNA沉淀。混匀后，4°C下7000rpm离心5分钟。
  ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟（不要过分干燥）。
  ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水10-40μl（依据RNA的沉淀块，若看不见沉淀，加10-20ul）用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80°C待用。

• finger (2015-8-03 17:30:41)

  PBS是应该用DEPC水配制的，还是普通的就可以？
  PBS最好是用DEPC水配制的，但普通的影响也不大，因为刚开始清洗细胞，清洗以后要用TRIZol裂解呢？此后的步骤均要求无RNA酶了，所以加TRIZol前影响不是很大。

• baidukk (2015-8-03 17:30:58)

  在trizol处理前你的试剂枪头都可以随便，之后ep管，枪头，水等都必须去RNA酶

• am10 (2015-8-03 17:31:15)

  
  Trizol处理前细胞是活的，没必要用无RNase的PBS，到了Trizol一步时一切都解决了。

• caihong (2015-8-03 17:31:33)

  
  2.1.2 贴壁培养细胞
  1) 倒出培养液，用1×PBS 清洗一次。
  2) 按每10 cm2 生长细胞加2 mL TRIzol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的细胞用细胞刮刮离表面）。
  3) 将裂解液及细胞转移至一离心管中，用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠。
  4) 在15~30℃放置5 min1) 向裂解液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），在15~30℃放置3 min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。
  2) 于4℃，12000 g，离心15 min（加速度：减速度=9:1）。
  3) 从离心机中小心地取出离心管，吸取体积约为TRIzol 试剂起始加入量一半的上清至另一无RNA 酶的离心管（切忌吸动白色中间相）。
  4) 向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15~30℃放置10 min（如果没有明显沉淀，可以-20 度过夜）。
  5) 于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）。
  1) 小心弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇1mL（切勿触及沉淀），轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小
  心弃去乙醇。
  2) 再加入75%乙醇1 mL，在涡旋器上短暂涡旋（使沉淀悬浮于75%乙醇水中）；于4℃，8000 g 离心
  10 min。
  3) 小心弃上清，短暂离心，用枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min 使乙醇挥发。
  4) 加入适量的RNase-free Milli-Q，用枪吸取Milli-Q 水轻轻吹打沉淀，使其悬浮于Milli-Q 水中，50℃保温10 min，待RNA 沉淀完全溶解后，-80℃保存。
  5) 一般来说，总RNA 沉淀应该快速地溶于Milli-Q 水中（正常的现象是，沉淀在Milli-Q 水中快速旋转并且同时溶解）。但是，某些RNA 沉淀，可能在悬浮于Milli-Q 水10 min 后仍有固体物存在，则于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）后，转移上清至另一1.5 mL 离心管-80℃保存。剩余的固体物加入Milli-Q 水后也保存于-80℃。
  6) 一般说来，用TRIzol 提取到的总RNA 中盐含量是比较高的，因此沉淀的洗涤非常重要。上清和管壁上残留的液体要尽量除去干净。

• Ao7 (2015-8-03 17:31:51)

  
  相关疾病：
  痛风
  抽提RNA的步骤大致类似，现在也有现成的试剂盒，如果实验条件允许可以直接购买，稳定性很好。我用的是QIAGEN的。但实验室也有用Trizol抽提的，效果也不错。
  其实我觉得抽提RNA最重要的是，每一步都要特别“干净”。与RNA接触的任何器具都须是RNase free的。在抽提过程中最好戴上口罩，在专用的工作台进行操作，不要说话，尽量避免剧烈的空气流动。原则就一条，RNAase无处不在，而RNA非常脆弱，更要小心呵护才是。
  遵循“干净”的原则，基本上按照相关步骤操作都能抽提出来。我第一次做是在关了通风的超净台里做的，虽然被师兄师姐们认为是有点小题大做，但抽提的质量和数量都非常好。
  以上意见供楼主参考Smile

• yonger (2015-8-03 17:32:59)

  谢谢各位！昨天倒是提出来了，但RNA含量不高，只有0.12mg/ml.OD260/280为1.5.反转录后跑PCR，发现B-actin有条带，目的基因没有。引物没有问题，用别的模板（组织）能扩出来。请问是否可能该细胞中不表达我的目的基因？还是有可能模板质量有问题？

• newway (2015-8-03 17:33:27)

  
  各位好，本人培养的是大鼠原代心肌细胞，提取了6次rna，效果都不甚理想，5s带比较明显。我想问问，死细胞粘附在活细胞上过多对提取有没有什么影响，会不会使降解速度增加。我已经找不到其他问题了，真是郁闷！！！

• caihong (2015-8-03 17:33:54)

  
  我提醒一下：楼主用的TRIzol是什么公司的？
  我用的是正宗Invitrogen公司的TRIzol，做的细胞都没什么问题……
  曾经用过“晶*”公司的TRIzol就不行……不要相信哪个公司的TRIzol都一样的话……

• zhihui小新 (2015-8-03 17:34:13)

  借人气问个问题,我连续三次提取的RNA Ratio 260/280 总是在1.4左右,可是试剂和方法和以前一样,(以前一直在1.8左右),我吸取的上清很少,绝对没有碰到蛋白层,还有可能是什么原因呢?