【求助】real-time PCR 关于融解曲线的疑问

最新回复

• ero11 (2015-10-07 16:38:42)

  
  我们是因为仪器设置，也出现这个情况，你可以改一下，工具栏上面，第11个，2旁边那个，好像连加符号，点下，出现对话框，analysis term settings ,点下smoothing,吧moving average里的两项都改成3，下面的改成0.25确定即可

• summerxx (2015-10-07 16:40:24)

  融解曲线越窄越尖锐，说明产物越纯，表达丰度越高，相反，如果峰比较宽，说明产物不是很纯，如果跑电泳，是目标条带附近（很近）有弥散带。
  融解曲线是温度——荧光信号的一阶负导数的二维曲线，我们通常所说的融解曲线，实际上是通过温度——荧光数据计算后的曲线，二楼所说的是数据处理的方法，由于实际上实验得到的是离散数据，所以在数据处理时的方法会导致融解曲线看起来变宽或者变窄。在分析方法一致的情况下，融解曲线表征的是产物纯度，高度表示的是表达丰度。

• txwuyan (2015-10-07 16:40:47)

  我的目的基因的融解曲线没有主峰，只有2个较宽的峰，而且峰宽且低，是什么原因？内参的融解曲线，主峰最高点所对应的温度是87.5度，在最后95度时有点上翘，是什么原因呢？
  验证引物，只看融解曲线救可以吗？
  刚刚开始试验，特此请教。

• woshi (2015-10-07 16:41:05)

  建议把融解曲线图贴上来看看分析会更清楚一些。
  如果目的基因的融解曲线没有主峰，那么说明没有目标产物的扩增，或者说是目标产物扩增的很少。2个较宽的峰，如果Tm在80度以下，多半是引物二聚体，如果在80度以上，可能是非特异性扩增。一般宽的峰电泳结果表征的像弥散带。
  95度时有点上翘没有关系，跟仪器或者仪器的分析软件相关，最好贴张图看看，上翘的是什么情况，应该与实验没有太大关系。
  验证引物，最好还是跑电泳，电泳的结果是最直观和准确的，融解曲线只是染料法的一张辅助分析手段（染料法相对探针法来说，特异性不足）。
  一般做定量PCR的步骤：1、常规PCR，摸索实验条件、验证试验体系，结合电泳进行分析；2、定量PCR，通过扩增曲线进行绝对定量或相对定量，染料法可结合融解曲线进行扩增产物的特异性分析。
  即便是做定量PCR，建议最好也要跑个电泳，如果发文章的话，放上扩增曲线，Ct值分析结果、融解曲线，再加上漂亮的电泳图，就比较有说服力了。

• whitesheep (2015-10-07 16:41:29)

  你好。我最近利用takara荧光试剂盒进行荧光定量PCR，所使用的仪器是rotor gene3000.试验已经进行一个半月，预试验尚未成功。荧光扩增曲线还行，CT值大约在20-25之间，各期均较明显。但是溶解曲线有多峰，并且内参也出现双峰。咨询师兄师姐均无应用rotor gene3000进行试验的。我想请教一下关于rotor gene 3000的PCR大体反应条件，以及我的引物是否合适。（见附图）还有进行普通PCR验证引物的特异性时所需的PCR条件是多少，怎么设定？是根据文献吗？还是根据说明书自己摸索？若普通PCR跑出的电泳很好，是否可以利用普通PCR的条件进行荧光定量PCR？

  
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• whitesheep (2015-10-07 16:41:45)

  
  溶解曲线有多个小峰，并且内参没有主峰。希望指教！感激不尽呀！

  
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• whitesheep (2015-10-07 16:42:04)

  
  溶解曲线有多个小峰，并且内参没有主峰。希望指教！感激不尽呀！

  
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• loli (2015-10-07 16:42:27)

  Corbett的仪器还是不错的，rotor gene 3000使用20~40ul的体系可能会比较好，我也没用过，不过看过不少资料，rotor gene的温控一致性要优于板式的PCR。
  反应体系来说，如果你使用takara的试剂盒，好像试剂盒是有针对不用仪器的推荐条件的，如果里面没有针对rotor gene3000的，就可以参照roche的体系配置，至于实验条件的设置，rotor gene的升降温速度没有roche那么快，倒是可以参照ABI 7300或7500.
  从融解曲线的结果来看，扩增产物中存在引物二聚体和一些非特异性扩增产物，至于实验条件，个人建议根据试剂说明书的推荐自己再摸索一下。一般比较重要的是退火温度，退火温度提高一些，引物二聚体会减少，但太高会影响目标产物的量。根据引物对退火温度精度的要求不同，可以在2~4度附近、上下进行调整，如果普通PCR电泳好，当然可以借用普通PCR的条件，只不过体系配置上要加入染料，还要进行一些调整，实验条件上要看看荧光定量PCR仪器的升降温速度，照搬过来的条件有时不一定适用，但在2度之内改变下退火温度，一般就可以了。
  个人的一点建议，不一定有用，呵呵

• yayya (2015-10-07 16:42:45)

  
  各位好:我是实验新手,最近也利用染料进行荧光定量PCR,出现一些问题，请各位大侠指点.我的扩增曲线基本算是可以,但是溶解曲线出现双峰,即在主峰前面有1-2个小峰.考虑为引物二聚体,提高退火温度从60-66度,减少引物的量,仍然有峰,并且峰无明显消退的趋势,请问各位是什么原因?还需要怎么改进?多谢指点不胜感激!

• woshi (2015-10-07 16:43:00)

  多设计几对引物，普通PCR电泳，找到好用的，是比较省事的方法，可能要稍微浪费点钱

• idea2011 (2015-10-07 16:43:17)

  
  遇到这种情况，一味的提高退火温度是没用的，因为在提高退火温度的同时你的扩增效率也在降低。建议使用一些软件如primer5或其它在线引物设计工具重新设计合成引物，不要再在这个上面浪费时间了。

• Darcy (2015-10-07 16:43:38)

  原因分析：1，引物特异性不强；2，条件不合理；3.模板浓度不高。
  处理：1，梯度PCR摸条件；
  2，条件摸好仍不行，重新设计引物；
  3，引物设计最好自己多设计几对，同时订购，同时摸条件（反正引物不贵的）；
  4，公司设计（哈哈哈）；
  5，作实验要集中时间，不能三天打鱼两天晒网。

• Darcy (2015-10-07 16:45:39)

  
  重新设计引物！

• seagate (2015-10-07 16:45:55)

  
  做了好多定量，绝对的、相对的，也来说说一点心得：
  1、引物设计是关键中的关键。合适的引物，都不用优化条件，退火温度波动几度都能出漂亮的条带。花大力气摸索温度、体系还不如花个几十块钱合条引物来的直接。可以多设计几条引物，然后筛选一个比较好的。
  2、稀释引物尽量使用新配制的无菌te，dd水稀释的引物不够稳定，te对反应的影响可忽略不计。
  3、一定要在普通pcr跑出稳定的漂亮的结果再上定量。
  4、耗材有米的话用原厂，没米的就进口有牌子的如axygen等，当然不同的机器要不同对待，上方检测的盖子要光学级，管壁检测管子就需要光学级盖子就无所谓了，底部检测估计只能原厂了。
  5、试剂的话，尽量买mix，用过tiangen takara abi toyobo的，感觉toyobo酶活差一点其他都差不多。自己兑的mix极不可靠，就别考虑了。
  6、相对定量需要多做几次标准曲线的摸索，调整目的基因和看家基因的扩增效率后再大批量检测。
  就这么多，希望和战友们多多交流